[發(fā)明專利]一種多模塊DNA文庫及轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶質(zhì)粒的構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310659979.9
• 申請日: 2013-12-09
• 公開（公告）號: CN103695452B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳昭;孫文頁
• 申請（專利權(quán)）人: 上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C40B40/08;C40B50/06
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司31227
• 代理人: 吳瑾瑜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種TALE連接單元庫、包含該TALE連接單元庫中所有TALE連接單元的DNA文庫以及轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶質(zhì)粒的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

按照人類的意愿對基因組進(jìn)行定向靶向修飾一直是許多科學(xué)家的夢想。在內(nèi)源的基因組上特異地刪除或加入我們需要的序列，一方面可以構(gòu)建出各種動(dòng)物模型用于生物學(xué)基礎(chǔ)研究和疾病機(jī)理研究，另一方面可以生產(chǎn)動(dòng)物反應(yīng)器用以廉價(jià)生產(chǎn)我們需要的又很難從其他途徑得到的生物組分。人們一直沒有找到簡單高效的方法對基因組進(jìn)行基因組靶向修飾。傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)依賴于細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源染色體隨機(jī)交換，其打靶效率非常低，通常只有10^-6-10^-8，這種打靶方法只在小鼠中得到了廣泛了應(yīng)用，而在其他模式動(dòng)物及大型哺乳動(dòng)物中都因效率太低而得不到廣泛應(yīng)用。

2009年兩個(gè)研究組發(fā)現(xiàn)植物病原體Xanthomonas中的一種可以調(diào)節(jié)植物基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子（transcription?activator-like?effector，TALE）表現(xiàn)出DNA結(jié)合特異性，而其識別密碼具有模塊化和簡單化的特點(diǎn)，為科學(xué)家們開發(fā)出更簡易的新型基因組靶向修飾技術(shù)帶來了新希望。

TALE與Fok1融合后即形成轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（transcription?activator-like?effector?nucleases，TALEN）。TALEs由數(shù)十個(gè)特異性識別DNA的串聯(lián)“蛋白模塊”和兩側(cè)的N-末端及C-末端序列組成。每個(gè)“蛋白模塊”包含34個(gè)氨基酸，第12和13位殘基是靶向識別的關(guān)鍵位點(diǎn)，被稱作重復(fù)可變的di-residues（RVDs）位點(diǎn)。

實(shí)踐中，TALEN技術(shù)大大提高了基因打靶效率，應(yīng)用范圍和可操作性，但如何把十幾個(gè)高度重復(fù)的DNA的識別模塊組裝起來成為了TALEN廣泛應(yīng)用的一個(gè)限制因素。研究者們在怎樣制作TALEN做出了各種各樣的努力。有的采用化學(xué)合成的方法，有的采用兩步分子克隆的方法，也有的采用一步分子克隆的方法。但都有各自的缺陷，因?yàn)樾韬铣傻腄NA高度重復(fù)的序列化學(xué)合成非常困難，成本也非常高；兩步法因?yàn)樾鑳刹竭B接所以材料成本、時(shí)間成本、測序成本都較高；現(xiàn)在公開的唯一一個(gè)可一步連接的方法最多只能連接14個(gè)識別模塊，而自然界中常見的識別模塊的長度為12-23，在實(shí)際應(yīng)用中很多情況需要大于14個(gè)識別模塊的TALEN，14個(gè)片段長度的限制不止影響此種方法應(yīng)用，而且不利于TALEN特異性的提高，并且因其需要酶切，純化，再連接造成操作繁瑣，工藝流程復(fù)雜，酶切純化后的DNA保存困難，特別是單鏈的尾巴容易降解。

以前有研究者用單模塊連接TALEN，如連接18個(gè)識別模塊，一個(gè)反應(yīng)連接18個(gè)片段難度非常大，世界范圍內(nèi)還沒有人能實(shí)現(xiàn)；以前也有建立在雙模塊基礎(chǔ)上的研究，但其只能連接14個(gè)識別模塊。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子（TALE）連接單元庫，利用該連接單元庫可以連接19個(gè)以上的識別模塊。

本發(fā)明還提供了利用上述連接單元庫，連接TALENs識別模塊的方法。

技術(shù)方案為：

I.轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括連接TALENs識別模塊的連接，步驟包括：

（1）根據(jù)所需識別目的基因靶序列的堿基序列，從多模塊單元庫中選擇對應(yīng)的連接單元；

所述的多模塊單元庫包括包括16組×n個(gè)雙堿基連接單元和4組×m個(gè)單堿基識別連接單元，同一組的所有雙堿基連接單元或單堿基連接單元兩端粘性末端的序列互不相同；所需識別的堿基序列長度為2*n+2-m至2*n+1；優(yōu)選的，n=10-15，m=3-9；本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方式中，n=12，m=7；

所述的單堿基連接單元為識別一個(gè)堿基的單堿基識別模塊及兩端經(jīng)二類限制性內(nèi)切酶酶切形成的第一粘性末端和第二粘性末端；任意兩組單堿基連接單元的粘性末端堿基序列一一對應(yīng)相同；對單堿基連接單元進(jìn)行順序編號，第k個(gè)單堿基連接單元I的第二粘性末端與第k+1個(gè)單堿基連接單元I的第一粘性末端互補(bǔ)，1≤k≤m-1。所述的單堿基識別模塊為編碼SEQ?ID?No.1～4所示氨基酸序列的核苷酸。