[發明專利]一種多模塊DNA文庫及轉錄激活子樣效應因子核酸酶質粒的構建方法

有效

• 申請號: 201310659979.9
• 申請日: 2013-12-09
• 公開（公告）號: CN103695452B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 吳昭;孫文頁
• 申請（專利權）人: 上海斯丹賽生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C40B40/08;C40B50/06
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司31227
• 代理人: 吳瑾瑜

1.轉錄激活子樣效應因子核酸酶質粒的構建方法，包括連接TALENs識別模塊的連接，步驟包括：

（1）根據所需識別目的基因靶序列的堿基序列，從多模塊單元庫中選擇對應的連接單元；

所述的多模塊單元庫包括：

16組×n個雙堿基連接單元和4組×m個單堿基識別連接單元，所需識別的堿基序列長度為2*n+2-m至2*n+1；n=10-15，m=3-9；

所述的單堿基連接單元為識別一個堿基的單堿基識別模塊及兩端經二類限制性內切酶酶切形成的第一粘性末端和第二粘性末端；任意兩組單堿基連接單元的粘性末端堿基序列一一對應相同；對單堿基連接單元進行順序編號，第k個單堿基連接單元的第二粘性末端與第k+1個單堿基連接單元I的第一粘性末端互補，1≤k≤m-1；

所述的單堿基識別模塊為編碼SEQ?ID?No.1～4所示氨基酸序列的核苷酸；

所述的雙堿基連接單元為識別兩個堿基的雙堿基識別模塊及兩端經二類限制性內切酶酶切形成的第一粘性末端和第二粘性末端；任意兩組雙堿基連接單元的粘性末端堿基序列一一對應相同；

所述的雙堿基識別模塊為編碼SEQ?ID?No.5～20所示氨基酸序列的核苷酸；

每組雙堿基連接單元分為兩個部分，第一部分的雙堿基連接單元數量為p個，對第一部分雙堿基連接單元進行順序編號，第i個雙堿基連接單元的第二粘性末端與第i+1個雙堿基連接單元的第一粘性末端互補，1≤i≤p-1；第二部分的雙堿基連接單元數量為q個，對第二部分雙堿基連接單元進行順序編號為p+2～n+1，第j個雙堿基連接單元的第二粘性末端與第j+1個雙堿基連接單元的第一粘性末端互補，p+2≤j≤n+1；其中，每組第一部分的最后一個雙堿基連接單元的第二粘性末端與編號為第p+1個單堿基連接單元的第一粘性末端互補；每組第二部分的第一個雙堿基連接單元的第一粘性末端與編號第p+1個單堿基連接單元的第二粘性末端互補，1<p+1≤m；各組雙堿基識別模塊的粘性末端堿基序列一一對應相同；

每個單堿基或雙堿基連接單元的粘性末端有4個堿基，沿5’-3’方向，正義鏈的第一粘性末端的第2～4個堿基編碼亮氨酸，正義鏈的第1個堿基為甘氨酸密碼子的最后一個堿基；正義鏈的最后兩個堿基為甘氨酸密碼子的前兩個堿基；沿5’-3’方向，反義鏈的第二粘性末端的第1～3個堿基的互補序列編碼亮氨酸，第4個堿基的互補序列為甘氨酸密碼子的最后一個堿基；反義鏈的前兩個堿基的互補序列為甘氨酸密碼子的前兩個堿基；

同一組的所有雙堿基連接單元或單堿基連接單元兩端粘性末端的序列互不相同；

（2）用二類限制性內切酶和DNA連接酶，將連接單元重組接入TALENs載體中，用消化線性DNA的酶進行消化處理，得到轉錄激活子樣效應因子核酸酶質粒。