[發明專利]一種檢測RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的方法及試劑盒

無效

• 申請號: 201310659976.5
• 申請日: 2013-12-09
• 公開（公告）號: CN103642920A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 曾靈;蔣建新;杜娟;王海燕;顧瑋;岳彩黎
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所 11308
• 代理人: 黎昌莉

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及適用于雙重PCR結合雙重焦磷酸測序技術檢測RAGE家族基因標簽SNP位點的試劑盒及方法。

背景技術

糖基化終產物受體（RAGE）是一個細胞表面分子的免疫球蛋白超家族的有多重配體的成員。自1992年被成功分離以后，越來越多的研究表面RAGE在血管疾病的發病機制中起著重要作用。RAGE不僅在大血管病變的發生過程中起放大血管炎癥，加速動脈粥樣硬化的作用，還作為一個開關調控著參與血管病變的各種信號的傳遞過程。不同的生化因素及信號通路產生的信號分子最終都必須通過活化RAGE通路才能參與到糖尿病血管病變過程中去。近幾年，RAGE在膿毒癥發病機制中的作用也日益受到重視。動物實驗發現，盲腸結扎穿孔所致的膿毒癥模型中，RAGE^-/-小鼠的存活率顯著高于野生型小鼠。即使在致膿毒癥模型24小時后注射RAGE的單克隆抗體，仍然可以顯著降低小鼠的死亡率。Bopp?C等也發現膿毒癥患者血漿sRAGE水平顯著升高，且與患者臨床結局密切相關。這些研究結果提示，RAGE是膿毒癥發病環節中的重要分子。

單核甘酸多態性（SNP）是指染色體上單個核苷酸變異引起的群體中DNA序列多態性，具有密度高、遺傳穩定、易于自動化分析等特點，被認為是繼限制性片段長度多態性、微衛星多態性之后的第三代遺傳標記，可用于基因定位、多態性分析等方面，是研究疾病遺傳易感性、疾病診斷、藥物篩選等的常用指標。目前已發展了20余種SNP檢測方法，如直接測序法、探針雜交法、飛行質譜分析法、限制性片段長度多態性分析法等，但因這些方法的費用、準確性和適用規模等方面的缺點，局限了基因多態性與疾病發生、發展和預后的遺傳關聯研究。而焦磷酸測序技術是新一代基于酶級聯反應的DNA序列分析技術，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協同作用下，將DNA單鏈上的每一個dNTP聚合與一次熒光信號釋放偶聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。該技術具有其獨特的優勢，無需電泳、DNA片段無需熒光標記；具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量、靈敏度高等特點，符合臨床大樣本檢測要求。

發明內容

本發明的目的之一在于提供RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的檢測方法，其能夠簡捷、直觀、準確的對RAGE標簽單核苷酸多態性基因型進行檢測和判讀結果。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

一種檢測RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點的方法，具體包括以下步驟：1）特異性引物的設計，即根據被證實的RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點，設計特異性擴增引物和測序引物，其中，所述特異性擴增引物中的一條用生物素標記；2）PCR擴增，即以待測標本的DNA為模板，用步驟1）所述的特異性擴增引物進行PCR擴增，得PCR擴增物；3）焦磷酸測序，即將步驟2）所得PCR擴增物采用堿變性使其分開成單鏈，取其中被生物素標記的單鏈PCR擴增產物純化后，與步驟1）所述測序引物進行雜交反應，并分析結果以判斷所述待測標本的RAGE家族基因標簽單核甘酸多態性位點靶單核甘酸是否具備多態性。本技術方案的創新點主要在首次采用采用焦磷酸測序法檢測RAGE家族基因的單核甘酸多態性。