[發明專利]一株番茄紅素高產菌株及其應用

有效

• 申請號: 201310659371.6
• 申請日: 2013-12-10
• 公開（公告）號: CN103667081A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 姚忠澤
• 申請（專利權）人: 常州臻揚生物工程有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P5/02;C12R1/645
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 王月霞

技術領域

本發明涉及微生物發酵領域，具體涉及一種番茄紅素高產菌株及其誘變方法與其在發酵生產番茄紅素中的應用。?

背景技術

類胡蘿卜素是一類在水果和蔬菜中大量存在的化合物，由于其具有作為抗氧化劑和維他命a前體的性質，所以是廣泛研究的主題。番茄紅素有優越的生理功能，其抗氧化作用優于β-胡蘿卜素，具有抗癌、防癌、活化免疫細胞的功能，廣泛應用于食品、藥品、化妝品和保健行業。?

番茄紅素是一種類胡蘿卜素，其化學式C₄₀H₅₆，分子量為536.85。分子結構如下：?

番茄紅素具有化學合成和天然來源。化學合成由于合成途徑中可能存在一些化學中間體雜質，因此近年來已經被大多數歐美國家所禁止，而天然來源的番茄紅素則無此弊端。天然來源的番茄紅素一般有三種生產方法，分別是天然植物提取、鹽藻法和微生物發酵法生產。其中微生物發酵法生產番茄紅素因不受環境條件限制、產量高、易于實現工業化生產而成為越來越多研究機構和廠家關注的對象。

國內外用于番茄紅素生產的微生物菌種主要有紅酵母，絲狀真菌等，但最廣泛用到的又以三孢布拉霉為多。因此越來越多科研機構和生產廠家將精力投入到改良和篩選三孢布拉霉的工作中。CN1920046公開了一種三孢布拉霉生產番茄紅素的方法，通過三孢布拉霉正負菌混合的方法，發酵產生番茄紅素。但由于正負菌需按比例混合發酵，在此過程中操作繁瑣，且增加了染菌的風險。上述技術方案有待進一步提高。?

發明內容

本發明要解決的技術問題之一在于提供一株三孢布拉氏霉菌，采用該菌發酵，無需添加阻斷劑，無需正負菌需按比例混合發酵，即可發酵生產番茄紅素，且產量較高。?

本發明要解決的技術問題之二在于提供上述三孢布拉氏霉菌在發酵產番茄紅素中的應用。?

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：?

一株番茄紅素高產菌株，其分類命名為三孢布拉氏霉菌（blakeslea?trispora）?V-6515，已于2013年11?月20?日保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，地址：中國?武漢?武漢大學，保藏編號：CCTCC?NO：M?2013583。

本發明所述的番茄紅素高產菌株三孢布拉氏霉菌blakeslea?trispora?V-6515的誘變篩選方法是：將VR-5(-)為出發菌株，經亞硝基胍誘變后，通過搖瓶發酵篩選獲得番茄紅素產量高的菌株作為下一輪誘變的出發菌株，重復上述誘變過程，最后篩選出番茄紅素產量高的目標菌株。?

本發明菌株的形態學及生理生化學特征如下：?

菌落在PDA培養基上為淺黃色，在好氧條件下生長，菌落個體大，圓形菌落，菌絲體厚，邊緣整齊，質地均勻；適宜生長溫度為27.5～28.5℃。適宜生長pH為7.0～7.2.

本發明所提供的番茄紅素高產菌株的誘變方法，具體步驟如下：

(a)、單孢子懸浮液制備：將三孢布拉氏霉菌出發菌株孢子制成孢子懸液，鏡檢無細胞重疊。

(b)、為了獲得番茄紅素高產菌株，經過對比多種誘變方法，選用亞硝基胍(MNNG)誘變三孢布拉氏霉菌（blakeslea?trispora）菌株的方法。從在液體培養基中的三孢布拉氏霉菌（blakeslea?trispora）培養物中獲得待誘變的細胞混懸液。在20℃和100rpm下，將10⁸細胞／ml在250ug／ml?MNNG溶液的0.1M檸檬酸鈉緩沖液，pH5.0中溫浴60～120min，然后將誘變細胞在液體培養基中，26～30℃、100rpm下培養10小時。?

(c)、誘變菌株的篩選：?

篩選：將步驟(b)誘變得到的固體單菌落接入種子培養基，在培養溫度26~30℃，200rpm搖床轉速下擴大培養36～60h后，按5~15%(v/v)的接種量接入發酵培養基。26~30℃，200rpm搖床轉速下培養60～84h后下搖床，取3mL發酵液于離心管中，3500rpm高速離心10min，棄上清液，加入甲醇至9mL，在快速混勻器上震蕩30min；3500rpm高速離心10min，取上清液測定發酵液中番茄紅素含量。取發酵番茄紅素含量最高的菌株作為下次誘變的出發菌株，重復步驟(a)?~(c)，直至篩選出番茄紅素產量高的目標菌株三孢布拉霉blakeslea?trispora