[發明專利]用反向載體法構建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體工程藍藻

有效

• 申請號: 201310658994.1
• 申請日: 2013-12-08
• 公開（公告）號: CN103642830B
• 公開（公告）日: 2017-03-22
• 發明（設計）人: 賈曉會;施定基;候李君;米華玲;胡文利;陳宇清;王曉燕;田琪琳;黃希文;何培民
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/12;C12P7/64;C12R1/89
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司31227
• 代理人: 吳瑾瑜

技術領域

本發明涉及生物技術和微藻能源領域，具體為構建一種工程藍藻為生產生物柴油和必需脂肪酸提供原料。

背景技術

用哪種微藻制備生物柴油，已成國內外開發生物能源的關鍵之一。從1978年美國能源部啟動“水生物種計劃（Aquatic?Species?Program，ASP）”以來35年中，各國學者在開發微藻能源上取得了許多進展。近6年Chisti(2007)和Hu等（2008）對微藻特性的進一步闡明，全球掀起了用微藻制備生物柴油的熱潮。微藻這個群體，可分為真核藻和原核藻。真核微藻含脂率較高，一直受到大家的關注；然而藍藻（又名藍細菌）是原核微藻，除了含脂率較低，有許多優點值得注意，可以利用。例如絲狀體魚腥藻7120(Anabaena?sp?PCC?7120)能固氮，可生長在無氮營養液中，不易受其它藻類和植物干擾；不通氣或不攪拌，易沉淀便于采收；較耐高溫，30～35℃是最適生長溫度；基因水平操作較成熟；基因組序列測定已經完成。

長期以來提高藻類含脂率的主要方法是缺N（用于綠藻）、缺Si（用于硅藻）、處于休眠（用于葡球藻）等方法來降低生長率。這些方法實際上不能最終提高脂產率。為了提高其含脂率，我們用魚腥藻7120作材料，在基因水平上調控磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的表達。PEPC主要在四碳光合固碳途徑中起重要作用。有趣的是近20多年來證明它在進行非四碳光合的40多種藍藻中存在；用油脂植物還證明它在調控油脂和蛋白的合成中起關鍵作用。

發明內容

本發明的目的是用基因操作構建一種工程藍藻作為微藻生物柴油和生產必需脂肪酸較理想的原料。

技術方案為，用基因操作調控藍藻中pepc基因的表達，具體用反向載體法調控pepc基因在絲狀體魚腥藻7120(Anabaena?sp?PCC?7120)的表達。作為生物柴油和生產必需脂肪酸的原料，我們的工程藍藻是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶pepc基因反向表達的轉基因藍藻，所述藍藻為魚腥藻。通過構建pepc基因反向表達載體，并用三親結合法轉化魚腥藻，抑制pepc基因表達，在不降低生長速率的前提下，提高含脂率。

這種絲狀體工程藍藻的構建方法步驟如下：

（a）基于魚腥藻7120的pepc基因序列，設計和合成引物；

所用的引物序列為：

上游5’-GATGGGCAAGCCACAAAAGACC-3’；

下游5’-AGGATCCGCGGGACGAGAAC-3’

以魚腥藻7120的基因組為模板，釣取pepc基因；用PCR法擴增獲得pepc基因；

釣出的pepc編碼基因連接到pMD-18-T載體上，測序鑒定；與在GenBank中的pepc基因（編號為NP_488901）比對序列的準確率；

（b）選用在藍藻和大腸桿菌中都可擴增和表達的質粒載體pRL-489，將pepc基因與pRL-489質粒連接，構建反向穿梭表達載體并轉入大腸桿菌；優選的，所述大腸桿菌為DH5α或Tp107；鑒定反向穿梭表達載體的方法為：將所連接的載體用XbaI酶切后電泳，出現4個電泳條帶的為反向穿梭表達載體。

（c）將含有輔助質粒和結合質粒的大腸桿菌、步驟（b）獲得的帶有反向穿梭表達載體的大腸桿菌及純化后的野生型藍藻培養到對數生長中期，按照4.5～5.5:4.5～5.5:1的細胞數量比混合，通過三親接合轉移法用帶pepc基因的載體轉化藍藻；優選的，含有輔助質粒和結合質粒的大腸桿菌、步驟（b）獲得的帶有反向穿梭表達載體的大腸桿菌及純化后的野生型藍藻細胞數量比為5:5:1；

（d）用含抗生素的無氮BG11培養基或培養液篩選藍藻轉化子，用接種針把平板上的單藻落挑出，接種到液體培養液中生長，逐步提高抗生素濃度，能成活的就是轉化子；所述的抗生素為卡那霉素或硫酸新霉素。具體為：

（1）將混合后的細胞均勻涂在濾膜上，在無抗生素的BG11培養基上培養6～8天直至藍藻生長；

（2）然后在含抗生素濃度為15～30μg/mL的BG11培養基上培養18～24天篩選出對抗生素有抗性的藍藻單藻落；

（3）挑選生長較好的魚腥藻7120單藻落，置于抗生素濃度20～50μg/mL的培養液中培養5～8天；

（4）再經過2～4次逐級提高抗生素濃度的篩選培養，每次培養時間為5～8天，直至抗生素濃度提高到280～300μg/mL；