[發(fā)明專利]用反向載體法構(gòu)建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體工程藍藻

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310658994.1
• 申請日: 2013-12-08
• 公開（公告）號: CN103642830B
• 公開（公告）日: 2017-03-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 賈曉會;施定基;候李君;米華玲;胡文利;陳宇清;王曉燕;田琪琳;黃希文;何培民
• 申請（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/12;C12P7/64;C12R1/89
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司31227
• 代理人: 吳瑾瑜

1.構(gòu)建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體工程藍藻的方法，其特征在于，用反向載體法調(diào)控pepc基因在絲狀體魚腥藻7120的表達，步驟包括：

（a）以魚腥藻7120的基因組為模板釣取pepc基因；用PCR法擴增獲得pepc基因；

所用的引物序列為：

上游5’-GATGGGCAAGCCACAAAAGACC-3’；

下游5’-AGGATCCGCGGGACGAGAAC-3’

（b）pepc基因與pRL-489質(zhì)粒連接，構(gòu)建反向穿梭表達載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌；

（c）將含有輔助質(zhì)粒和結(jié)合質(zhì)粒的大腸桿菌、步驟（b）獲得的帶有反向穿梭表達載體的大腸桿菌及純化后的野生型藍藻培養(yǎng)到對數(shù)生長中期，按照4.5～5.5:4.5～5.5:1的細胞數(shù)量比混合，通過三親接合轉(zhuǎn)移法用帶pepc基因的載體轉(zhuǎn)化藍藻；

（d）用含抗生素的無氮BG11培養(yǎng)基或培養(yǎng)液篩選藍藻轉(zhuǎn)化子。

2.權(quán)利要求1所述構(gòu)建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體工程藍藻的方法，其特征在于，步驟（c）中，含有輔助質(zhì)粒和結(jié)合質(zhì)粒的大腸桿菌、步驟（b）獲得的帶有反向穿梭表達載體的大腸桿菌及純化后的野生型藍藻細胞數(shù)量比為5:5:1。

3.權(quán)利要求1所述構(gòu)建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體工程藍藻的方法，其特征在于，步驟（a）中，所述的pepc基因序列如SEQ?ID?No.1所示。

4.權(quán)利要求1所述構(gòu)建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體工程藍藻的方法，其特征在于，步驟（d）所述抗生素為卡那霉素或硫新霉素，所述的篩選藍藻轉(zhuǎn)化子的方法為：

（1）將混合后的細胞均勻涂在濾膜上，在無抗生素的BG11培養(yǎng)基上培養(yǎng)6～8天直至能看到藍藻生長；

（2）然后在含抗生素濃度為15～30μg/mL的BG11培養(yǎng)基上培養(yǎng)18～24天篩選出對抗生素有抗性的藍藻單藻落；

（3）挑選生長較好的魚腥藻7120單藻落，置于抗生素濃度20～50μg/mL的培養(yǎng)液中培養(yǎng)5-8天；

（4）再經(jīng)過2～4次逐級提高抗生素濃度的篩選培養(yǎng)，每次培養(yǎng)時間為5～8天，直至抗生素濃度提高到280～300μg/mL；

（5）用PCR技術(shù)檢測工程藍藻中的pepc基因，并用RT-qPCR法檢測藍藻中pepc基因表達。

5.權(quán)利要求1所述構(gòu)建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體工程藍藻的方法，其特征在于，步驟（b）中，鑒定反向穿梭表達載體的方法為：將所連接的載體用XbaI酶切后電泳，出現(xiàn)3個電泳條帶的為反向穿梭表達載體。

6.權(quán)利要求1所述構(gòu)建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體工程藍藻的方法，其特征在于，步驟（b）中，所述大腸桿菌為DH5α或Tp107。

7.權(quán)利要求1～6所述方法構(gòu)建的絲狀體工程藍藻在生產(chǎn)脂肪酸或生物柴油方面的應(yīng)用。

8.生產(chǎn)脂肪酸或生物柴油的方法，其特征在于，步驟包括：

（1）培養(yǎng)權(quán)利要求1～6所述方法構(gòu)建的絲狀體工程藍藻；

（2）收集絲狀體工程藍藻并洗滌、冷凍干燥得到干藻粉，并從干藻粉中抽提脂類物質(zhì)。

9.權(quán)利要求8所述生產(chǎn)脂肪酸或生物柴油的方法，其特征在于，步驟（1）所述培養(yǎng)條件為：

培養(yǎng)液：無氮的BG11培養(yǎng)液或培養(yǎng)基，pH=8.3～8.6；

溫度30±1℃，以白光或者白光與藍光和紅光混合作為光源，攪拌條件下培養(yǎng)5～8天；光照強度為50-80μmol·m^-2·s^-1；

攪拌的方式為振蕩培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)；振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為120～150rpm；通氣培養(yǎng)為通入含1%～2%體積比CO₂的空氣。