[發明專利]一種肝癌早期診斷試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201310657777.0
• 申請日: 2013-12-09
• 公開（公告）號: CN103675285A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 段升華
• 申請（專利權）人: 中山奈德生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 中山市銘洋專利商標事務所(普通合伙) 44286
• 代理人: 鄒常友

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種肝癌早期診斷試劑盒及檢測方法。

背景技術

國際衛生組織統計結果顯示，2008年全球有75萬肝癌新發病例，70萬肝癌死亡病例，男、女新發病例分別位于當年惡性腫瘤發病率的第五位及第七位，而男、女死亡病例分別位于當年惡性腫瘤死亡率的第二位及第六位。在所有肝癌患者中，肝細胞癌為最常見的一種組織學類型，占所有肝癌患者的70%-85%。

肝癌惡性程度高，病情發展迅速，若治療不及時或治療不當，則可使病情迅速惡化而致死亡。近年來，隨著人們生活方式的改變及其他各種因素的影響，我國肝癌發病率仍有逐年上升趨勢，我國每年死于肝癌的患者約有11萬人，約占世界肝癌死亡人數的45%，目前肝癌已經成為我國僅次于胃癌、食管癌第三位的惡性腫瘤死亡原因。

肝癌早期無明顯癥狀，若患者有自覺癥狀時，約有30%的患者已屬肝癌晚期，患者會感到肝區脹痛，出現不明原因的消瘦、發熱、乏力，體檢可見右上腹腫塊、肝大。針對肝癌患者上述臨床表現，對于肝癌的早期診斷顯得尤為重要。目前最為常用的肝癌細胞血清標志物為甲胎蛋白，甲胎蛋白是血液里含有的一種特殊蛋白質，只有在胎兒的肝細胞中才能合成，待胎兒從母體中娩出后一周內，胎兒體內的甲胎蛋白會完全消失，正常人的肝細胞是不產生甲胎蛋白的，可是當得了肝癌時，由于肝細胞癌變幼稚化無休止地生長，恢復合成甲胎蛋白的能力，這也是目前將甲胎蛋白作為診斷早期肝癌重要標志物的道理，目前，甲胎蛋白仍是臨床廣泛應用的原發性肝癌血清學診斷標志物，但其敏感性、特異性及準確性均不理想，因此，迫切需要新的更為準確可靠的肝癌標志物以期提高肝癌尤其是早期肝癌診斷的靈敏度和特異度。

發明內容

針對現有技術存在的上述缺陷，本發明的目的是提供一種靈敏度、特異度更高的

本發明的技術方案如下：

一種肝癌早期診斷試劑盒，所述的診斷試劑盒組成如下：酶標多肽抗體,包被緩沖液,清洗液,顯色液,封閉液,終止液和抗原包被的酶標板。

所述的酶標多肽抗體具體制備方法為：

（1）以合成肽Rep5為抗原免疫BALB/c小鼠，BALB／c小鼠，采用常規雜交瘤技術制備單克隆抗體，并制備小鼠腹水抗體，通過Pmtein?G柱將腹水抗體進行親和純化。

（2）采用辣根過氧化酶標記抗體，具體方法為：先吸取1-5mg純化后的單克隆抗體，加入新制備的100-200ul的碘酸鈉水溶液中，在4℃旋轉混合20-40min，加入100-200ul丙二醇水溶液，25℃混合20-40min，加入1-3mg多肽抗體，渦旋混勻后采用碳酸鈉緩沖液調節PH至9-10，在4℃下攪拌混合12-24h，加入硼氫酸鈉水溶液終止反應。

優選的，所述的小鼠腹水抗體效價為1：2000000-1：5000000

所述的包被緩沖液為PBS緩沖液。

所述的清洗液為含有0.05%-0.1%Tween?20的PBS溶液。

所述的顯色液為TMB顯色液。

所述的封閉液為The?Blocking?Solution封閉液。

所述的終止液為2-3mol/L的硫酸。

采用上述診斷試劑盒進行檢測的檢測方法，包括以下步驟：

（a）在抗原包被的酶標板中加入封閉液200-300ul，37℃靜置10-15min；棄封閉液，采用清洗液清洗3-5次；

（b）加入100-200ul的酶標多肽抗體，37℃靜置10-15min，棄酶標多肽抗體，采用清洗液清洗3-5次；

（c）加入100-200ul顯色液，37℃避光孵育10-15min顯色；

（d）加入50-100ul終止液終止反應；

（e）采用酶聯檢測儀測定吸光度值。

所述的吸光度值的測定波長為455nm。

和現有技術相比，本發明的有益效果如下：

1.目前，甲胎蛋白仍是臨就要上廣應應用的肝癌患者的血清學診斷標志物，但于腫瘤直徑小于3cm的肝癌患者，敏感性為33％-65％；