[發明專利]一種獲得植物高花青素含量毛狀根的方法

有效

• 申請號: 201310656046.4
• 申請日: 2013-12-06
• 公開（公告）號: CN103695460A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 劉寶龍;張懷剛;劉登才;張波;陳文杰;沈裕虎;魏樂
• 申請（專利權）人: 中國科學院西北高原生物研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/06
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域：

本發明涉及一種獲得植物高花青素含量毛狀根的方法，屬于植物技術領域。

背景技術：

花青素是一類陸生植物特有并普遍存在的水溶性色素，賦予植物器官紅、粉紅、藍和紫等色彩。作為食物，花青素不僅是優良的食品添加劑，而且具有抗心率失調，抗癌的功能，降低心血管疾病，肥胖癥，糖尿病的發病率。

花青素屬于酚類化合物中的類黃酮類化合物。基本結構單元是2-苯基苯并吡喃型陽離子，即花色基元。花色基元所帶羥基數、甲基化、醣基化數目、種類和連接位置的差異，形成200多種不同的化合物。這些不同結構的花青素會呈現不同顏色，具有不同的保健功能和藥用價值(范和邱，1998)。花色基元的羥基化，甲基化，糖基化等修飾由不同的基因控制。由于系統發生上的差異，不同植物可能所具有的花青素修飾基因有所差異，因此其所含有的花青素也有可能不同。例如，大牽牛天堂藍花中的一種花青素含有6個葡萄糖和3個咖啡酸，是目前發現的最大的花青素類化合物，還沒有在其它植物中發現。

目前花青素主要來源于產量較高的水果和蔬菜的塊莖和果實中，如紫甘薯、越橘、酸果蔓、黑枸杞、藍莓、葡萄、接骨木紅、黑加侖、紫胡蘿卜和紅甘藍。由于植物的來源較為單一，所以所獲得花青素的種類也就不是十分豐富。從更多植物中獲取花青素，是擴大花青素資源庫的重要手段。但是許多植物需要在特殊的環境下才能完成發芽，生長，開花，結果等生長發育過程，同時花青素也僅僅在植物特定器官中，如花中積累，其本身生物量較小，極大地限制了更多種類的花青素被人們使用。

毛狀根是發根農桿菌侵染宿主植物受傷部位的細胞產生的大量不定根。其生長迅速，激素自主，分化水平高，遺傳性狀穩定，是理想的生產次生代謝物質的組織。但自然情況下植物毛狀根中花青素的合成代謝積累較少。植物中花青素合成代謝的結構基因受MYB基因和bHLH基因的調控。已有研究者將分別過量表達MYB基因和bHLH基因的轉基因植株進行雜交，獲得同時過量表達MYB基因和bHLH基因的轉基因植株，該植株中花青素合成代謝的結構基因被誘導表達，在植物體內積累大量的花青素。毛狀根不能進行有性雜交，并且在一個載體中同時過量表達兩個基因的構建工作較為困難，因此高花青素含量的植物毛狀根的獲得較為困難。

發明內容：

針對上述問題，本發明要解決的技術問題是提供一種獲得植物高花青素含量毛狀根的方法。

本發明的一種獲得植物高花青素含量毛狀根的方法，它獲得的步驟如下：

(一)、設計包含AttB1adapter和AttB2adapter的引物，將植物中調控花青素合成代謝的MYB基因AmROS1和bHLH基因AmDEL通過Gateway克隆的BP反應連接到載體pDONR207；然后利用Gateway克隆的LR反應將AmROS1和AmDEL分別連接到載體PJAM1502(卡那霉素抗性)和載體pK7WG2D(壯觀霉素抗性)中獲得PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL；

(二)、利用電轉化的方法將PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL轉化到發根農桿菌Ar1193(利福平抗性)中，通過利福平、卡那霉素和壯觀霉素抗生素篩選，獲得PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL的發根農桿菌；

(三)、煙草在無菌培養基上發芽生長19天，在超凈臺中將煙草葉片剪成小方塊，侵染20分鐘，共培養2天后，在MS固體培養基(250mg/L塞福隆，50mg/L卡那霉素)培養20天后，在煙草的傷口處出現紫色毛狀根；

(四)、將毛狀根放入三角瓶中，并加入MS液體培養基(250mg/L塞福隆，50mg/L卡那霉素)，培養28天后，測定毛狀根中花青素含量為132mg/100g，接近水果藍莓中的花青素含量；

(五)、質譜鑒定毛狀根中含有3種花青素類化合物，與煙草花中花青素種類與結構相同。

本發明在植物毛狀根中同時表達調控花青素合成代謝的轉錄因子MYB基因和bHLH基因，獲得植物高花青素含量的毛狀根。

具體實施方式：

本具體實施方式采用以下技術方案：它獲得的步驟如下：