[發明專利]用于檢測菊黃東方鲀生長速度的引物對及方法

有效

• 申請號: 201310654636.3
• 申請日: 2013-12-05
• 公開（公告）號: CN103805694A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 張之文;施永海;張根玉;張海明;張中華;徐嘉波;鄧平平
• 申請（專利權）人: 上海市水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海三方專利事務所 31127
• 代理人: 吳干權

[技術領域]

本發明涉及菊黃東方鲀的檢測引物和方法，具體涉及檢測菊黃東方鲀生長速度的引物對及方法。

[背景技術]

菊黃東方鲀（Fugu?flavidus）俗稱艇巴、乖魚、菊黃、滿天星等，分類上隸屬鲀形目(Tetraodontif-ormes)鲀科(Tetraodontidae)東方鲀屬(Fugu)，主要分布于我國黃海、東海和渤海。由于其味道鮮美，營養豐富，頗受歡迎，是一種名貴的養殖種類。在養殖過程中，生長速度快的個體可以縮短養殖時間，提高飼料的利用率，節約養殖成本，因此培育篩選生長速度快菊黃東方鲀是水產養殖者追求的目標。目前在菊黃東方鲀中，與生長相關的分子標記研究是空白。

肌肉生長抑制因子（Myostatin,MSTN）最先從小鼠骨骼肌cDNA文庫克隆到，它主要在肌肉組織中大量表達，屬于TGF-β超級家族。對MSTN基因敲除小鼠地研究表明，突變小鼠的體重比雜合體和野生型小鼠體重增加約30%，其中肌細胞增生（hyperplasia）和肌纖維肥大（hypertrophy）雙重作用所造成的肌肉肥大是造成體重增加的主要原因，并且這一特性與動物的性別及年齡無關，而且不影響動物的繁殖能力。因此，MSTN是肌肉生長的一個重要負調控主效基因。活化的MSTN與細胞膜表面受體（活化素受體蛋白II?B（ACVR2B）和活化素受體蛋白IB（ACVRB））相結合，可以激活下游的S媽的2/3和p38MAPK細胞內信號傳導途徑，從而調節各組織的生長發育。

在《黃顙魚MSTN基因多肽性及其與生長性狀的相關分析》（朱媛媛等，遺傳，2012年1月34（1）：72-78頁）一文中，披露了MSTN對黃顙魚生長速度的影響，通過轉基因技術和DNAi技術抑制斑馬魚的MSTN基因發現實驗魚的肌肉明顯比正常魚發達，因此認為該基因在動物肌肉生長發育中起到重要抑制作用，也可能參與脂肪的生成和調節。在魚類中，MSTN?mDNA可以在肌肉，眼，腦、腸、腮、腎、心、脾中發現，并且在不同的魚種中MSTN還分為兩類，MSTN1、MSTN2（牙鲆肌肉生長抑制素(MSTN)基因克隆，徐建勇、陳松林，水產學報第32卷第4期，2008年7月，497-498）。

[發明內容]

為了彌補現有技術的空白，提供一種能夠對于菊黃東方鲀生長速度進行檢測的引物對。

菊黃東方鲀中存在可用于篩選生長相關的片段，該片段位于菊黃東方鲀MSTN2基因3端非翻譯區域如序列SEQ?ID?NO：3及附圖1所示。其中框里陰影部分為GT重復的微衛星核心區域。在菊黃東方鲀中存在染色體加倍現象，在擴增過程中，其他拷貝上的片段也會出現擴增現象。

在上述發現的基礎上，發明一種檢測菊黃東方鲀生長速度的引物對，該引物對由堿基序列為SEQ?ID?NO：1的上游引物和SEQ?ID?NO：2的下游引物組成。

本發明還包括一種檢測菊黃東方鲀生長速度的方法，于由以下步驟組成，

提取樣品菊黃東方鲀的肌肉生長抑制因子的DNA序列，

采用上述引物對作為PCR擴增的引物對樣品進行PCR擴增；

將擴增產物進行PAGE、染色處理；

觀察對比各個樣品的條帶，條帶越多的個體生長速度越快。

上述方法還具有如下優化方案：

所述的PCR擴增的反應體系20μL，包括2ul?10×PCR緩沖液，0.8ul?10mmol/L的dNTP?mix,0.4μmol/L的上游引物，0.4μmol/L的下游引物，30ng的樣品菊黃東方鲀DNA。

所述的PCR擴增反應條件如下，94℃變性3分鐘，然后94℃變性30秒，55℃復性30秒，及72℃延伸30秒，42個循環，最后72℃延伸10分鐘。

通過本發明的引物對和檢測方法，能夠有效的對于不同個體的菊黃東方鲀的生長速度進行篩選，為人工育種提供有效的信息，篩選后能夠得到生長速度塊的個體養殖時間短，節約了養殖成本。并且其方法簡單、速度快，能夠廣泛的用于各個地域。

[附圖說明]

圖1為菊黃東方鲀MSTN2基因中的微衛星核心區域示意圖；

圖2位不同樣品菊黃東方鲀的PAGE條帶對比圖。

[具體實施方式]

下面通過具體實施例結合附圖對本發明做進一步說明，下述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非是對本發明的實施方式的限定。