[發明專利]一種基于EDC反應制備含氨基小分子物質與蛋白偶聯物最佳條件的篩選方法

在審

• 申請號: 201310654333.1
• 申請日: 2013-12-03
• 公開（公告）號: CN104672297A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發明（設計）人: 張峰;王曉偉;鐘睿博
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C07K1/113
• 分類號: C07K1/113
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域：

本發明涉及化學領域的連接方法，本專利敘述了基于EDC反應制備含氨基小分子物質和蛋白偶聯物最佳條件的篩選方法。

背景技術：

小分子物質經常被偶聯到一個較大的蛋白質分子上，作為半抗原應用在基于免疫反應的檢測、診療等領域。通常使用的方法主要是戊二醛交聯法和EDC交聯法，前者由于連接效率低，蛋白間交聯污染嚴重，且戊二醛本身增加了小分子和蛋白質間的鏈接距離，最終使得交聯物尺度變大等缺點，目前基本上被EDC交聯法所取代。實驗者在做EDC實驗時，都通常習慣于參考一些前人的分子配比，而不同的小分子所含氨基數量以及不同蛋白質的PI值，羧基與氨基之比，都在一定程度上具有較大差異，所以針對不同的蛋白質和小分子的交聯實驗應該重新確定其最佳分子配比。本專利中所采用的EDC法偶聯含氨基小分子物質和蛋白提供了一種快捷、高效、所需反應物量較小的優化反應方法，可為新的基于EDC的含氨基小分子物質和蛋白相偶聯篩選出反應的最佳條件。

發明內容：

本發明提供一種制備小分子和蛋白質偶聯反應最佳條件的高效、便捷的篩選方法，可以迅速確定偶聯反應中EDC與蛋白質以及小分子物質的分子個數比(物質的量之比)。其核心技術為，將EDC、蛋白質和小分子三者通過兩次濃度遞減系列實驗，再由電泳跑膠檢測反應結果所組成。

附圖說明：

圖1EDC法偶聯含氨基小分子和蛋白梯度表；

蛋白和含氨基小分子的分子個數比為1：500，EDC的分子個數比從1號到11號管依次減半。

圖2SDS-PAGE膠示意圖；

這12個條帶從右至左分別為1-12號管內樣品，其中第12條帶為對照樣。

具體實施方式：

1)取一排PCR管并編號1-12，向這12個管中分別加入10μL去離子水。

2)將10μL新配制的EDC水溶液(768mmol／L)加入到1號管中，移液槍混勻，從1號管中抽取10μL再加入到2號管中，移液槍混勻，再抽取10μL加入到3號管中，混勻后再抽取10μL加入到4號管中，混勻后再抽取10μL加入到5號管中，以此類推，直到從10號管混勻后抽取10μL再加入到11號管中，混勻后抽取10μL，棄之。

3)往1-12號管中分別加入10μL蛋白質(6μmol／L)和10μL小分子(3mmol／L)，室溫下反應3小時。

4)利用常規電泳法檢測如上樣品，通常采用10％的SDS-PAGE膠在100V電壓下跑膠2小時，考馬斯亮藍染色、脫色、拍照進行條帶滯后對比：可以迅速篩選出偶聯最佳條件之EDC分子用量(用量太多會導致蛋白質自身的交聯，太少又偶聯效率太低)。

5)將EDC與小分子樣品交換，重復以上1)-4)過程：其中需要將4)中找到的最佳EDC量應用于上述實驗，把持EDC與蛋白的分子比例恒定，變換小分子的物質的量(分子數：從1號到11號管依次減半，12號管是對照管)。

鑒于pH值和溫度是影響反應產率的關鍵因素，本行業的技術人員應了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內，本發明要求保護范圍由所附的權利要求書其等效物界定。