[發明專利]生產丙酮酸的菌株及其構建方法

有效

• 申請號: 201310653141.9
• 申請日: 2013-12-04
• 公開（公告）號: CN103882045A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 張學禮;張冬竹
• 申請（專利權）人: 合肥百邁生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21
• 代理公司: 合肥誠興知識產權代理有限公司 34109
• 代理人: 湯茂盛

技術領域

本發明涉及一種丙酮酸的生產領域，具體而言，本發明提供了一種用于從生產丙酮酸的菌株及該菌株的構建方法。

背景技術

丙酮酸是一種α-酮酸，在生物化學代謝途徑中扮演重要的角色。作為一種重要的有機酸，丙酮酸不僅是人體三羧酸循環和氨基酸合成過程中重要的中間體，同時在食品、化工和制藥工業及科學研究中有著廣泛的用途。在制造工業中，常被用作食品添加劑、重量控制添加劑、保健食品和抗氧化劑等。同時，因為丙酮酸既具有活性的酮基又具有活性羧基基團，因此常被作為一種重要的原材料廣泛的用于化工、制藥和農業化學品生產中，如其可以作為合成L-酪氨酸、N-乙酰-D-甘露糖胺丙酮酸及（R）-苯乙酰甲醇等制藥前體的原料。

目前丙酮酸的生產方法主要有化學法和生物法。其中，化學法生產丙酮酸在工業上主要是通過使酒石酸脫水和去羰基來合成。這種生產丙酮酸的方法操作簡單，但是污染重、成本高。生物法生產丙酮酸主要包括直接發酵、酶催化法和全細胞轉化法。發酵生產丙酮酸的菌株包括多種維生素缺陷型的酵母Torulopsis?glabrata、硫辛酸缺陷性的大腸桿菌和酵母菌株。目前酵母菌發酵生產的丙酮酸產量最高，可達135g/L，轉化率達0.54g/g。另外，重組大腸桿菌YYC202發酵生產丙酮酸的最高產量為110g/L，轉化率為0.87g/g。

發酵法生產丙酮酸有很多缺陷。由糖發酵生產丙酮酸的產率一直較低。另外，從發酵液中分離丙酮酸是一個復雜而且昂貴的過程。生物催化法作為一種替代方法應運而生。生物催化法生產丙酮酸可以通過全細胞催化或者酶催化完成。其中，全細胞催化生產丙酮酸是通過生物催化底物直接進行轉化，不需要復雜的生長培養基，減少了下游分離純化的成本。例如，在優化條件下，使用Pseudomonas?sp.g31菌株進行生物轉化，能夠在24h內將100mM的富馬酸轉化為94mM的丙酮酸。另外，使用大腸桿菌YYC202進行全細胞轉化由葡萄糖生產丙酮酸，最高轉化率為0.93g/g，這是發酵生產無法達到的。

實現工業化生物轉化法生產丙酮酸的關鍵是使用價格低于丙酮酸的原材料通過高效的轉化方法進行生產。目前，可用于生物催化法生產丙酮酸的底物主要包括D-丙氨酸、1，2-丙二醇，延胡索酸以及乳酸等。目前，已經有多種涉及的關鍵酶基因被克隆并進行了研究，但是使用這些酶進行生物轉化的條件還未優化。

為了實現全細胞催化法生產丙酮酸，需要選擇從較低成本的原材料出發，通過設計高效的生物催化途徑實現丙酮酸生產，并通過對反應途徑中關鍵酶蛋白活性進行優化以及對生物轉化條件的優化來獲得高效生物催化生產丙酮酸的方法。

發明內容

本發明的首要目的是提供一種生產丙酮酸的菌株及其構建方法，其可有效的用于生物轉換法生產丙酮酸。

一種生產丙酮酸菌株的構建方法，其構建方法如下：

將D-氨基酸氧化酶基因DAAO通過EcoRI或BamHI克隆在pUC57質粒中獲得質粒pUC57-DAAO，以質粒pUC57-DAAO為模板進行基因擴增，將基因DAAO擴增獲得的產物克隆至質粒pET28a或pET21a中，選取培養得到質粒中連接上含有DAAO的DNA片段的陽性克隆質粒，將上述構建好的陽性克隆質粒轉化進表達宿主菌BL21(DE3)中，選取培養得到能夠將D-丙氨酸轉化為丙酮酸的第一菌株；

D-氨基酸氧化酶基因DAAO片段大小為1124bp，含有核酸內切酶NdeI和EcoRI的酶切位點。

上述構建得到的菌株能夠直接通過生物轉換法將D-丙氨酸轉化為丙酮酸。

附圖說明

圖1為質粒pET28a-RgDAAO的示意圖；

圖2為質粒pACYCDuet-1-katE-alaR的示意圖。

具體實施方式

以下實施例是對本發明的進一步的說明，并不構成對本發明實質內容的限制。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑購買得到。

操作1D-氨基酸氧化酶基因的合成與克隆

D-氨基酸氧化酶（D-amino?acid?oxidase，DAAO）的合成與克隆，分為以下幾個操作：

步驟1：D-氨基酸氧化酶（D-amino?acid?oxidase，DAAO）的全基因合成：