[發(fā)明專利]生產(chǎn)丙酮酸的菌株及其構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310653141.9
• 申請(qǐng)日: 2013-12-04
• 公開（公告）號(hào): CN103882045A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張學(xué)禮;張冬竹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 合肥百邁生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N1/21
• 代理公司: 合肥誠興知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34109
• 代理人: 湯茂盛

1.一種生產(chǎn)丙酮酸菌株的構(gòu)建方法，其構(gòu)建方法如下：

將D-氨基酸氧化酶基因DAAO通過EcoRI或BamHI克隆在pUC57質(zhì)粒中獲得質(zhì)粒pUC57-DAAO，以質(zhì)粒pUC57-DAAO為模板進(jìn)行基因擴(kuò)增，將基因DAAO擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒pET28a或pET21a中，選取培養(yǎng)得到質(zhì)粒中連接上含有DAAO的DNA片段的陽性克隆質(zhì)粒，將上述構(gòu)建好的陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中，選取培養(yǎng)得到能夠?qū)-丙氨酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的第一菌株；

D-氨基酸氧化酶基因DAAO片段大小為1124bp，含有核酸內(nèi)切酶NdeI和EcoRI的酶切位點(diǎn)。

2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)丙酮酸菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，還包括：

以枯草芽孢桿菌168的基因組DNA為模板，基因擴(kuò)增枯草芽孢桿菌的丙氨酸消旋酶基因alaR，將基因alaR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒pACYCDuet-1的NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)構(gòu)建得到質(zhì)粒pACYCDuet-1-alaR；

以大腸桿菌的基因組DNA為模板，基因擴(kuò)增大腸桿菌的過氧化氫酶基因katE，將基因katE擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒pACYCDuet-1-alaR的SacI和SalI酶切位點(diǎn)構(gòu)建得到質(zhì)粒pACYCDuet-1-katE-alaR；

將構(gòu)建得到的質(zhì)粒pACYCDuet-1-katE-alaR電轉(zhuǎn)化入第一菌株中，構(gòu)建獲得能夠?qū)-丙氨酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的第二菌株。

3.如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)丙酮酸菌株的構(gòu)建方法，其特征在于：D-氨基酸氧化酶基因DAAO為CcDAAO或RgDAAO或TvDAAO；質(zhì)粒pUC57-DAAO為質(zhì)粒pUC57-CcDAAO或質(zhì)粒pUC57-RgDAAO或質(zhì)粒pUC57-TvDAAO，基因CcDAAO、RgDAAO、TvDAAO以及基因alaR、katE進(jìn)行基因擴(kuò)增和克隆所選用的引物分別如下：

4.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)丙酮酸菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，質(zhì)粒pUC57-DAAO為模板進(jìn)行DAAO基因擴(kuò)增的具體操作為：

擴(kuò)增體系為：NewEngland?Biolabs?Phusion5X緩沖液10μl、dNTP(每種dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phusion?High-Fidelity?DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸餾水33.5μl，總體積為50μl；

擴(kuò)增條件為：98℃預(yù)變性2分鐘(1個(gè)循環(huán))；98℃變性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸30秒(30個(gè)循環(huán))；72℃延伸10分鐘(1個(gè)循環(huán))；

DAAO基因擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pET28a或pET21a質(zhì)粒中的具體操作為：

將基因DAAO擴(kuò)增獲得的DAAO基因的PCR片段進(jìn)行清洗純化，獲得含有DAAO基因的DNA片段（1124bp）；

酶切體系為：0.2μg的DAAO?DNA片段，2μl10*CutSmart?Buffer，1μl?NdeI，1μl?EcoRI-HF，補(bǔ)充蒸餾水至20μl，37℃溫浴10分鐘，然后瓊脂糖凝膠回收獲得酶切好的含有DAAO的DNA片段；

質(zhì)粒pET28a或pET21a的酶切體系：1μg的質(zhì)粒pET28a或pET21a，2μl10*CutSmart?Buffer，1μl?NdeI，1μl?EcoRI-HF，補(bǔ)充蒸餾水至20μl，37℃溫浴10分鐘，然后瓊脂糖凝膠回收獲得酶切好的含有pET28a的DNA片段；

連接體系：10ng酶切回收的pET28a片段，20ng?RgDAAO的DNA片段，2μl?Quick?Ligation?Reaction?Buffer，加蒸餾水補(bǔ)充至10μl，然后加0.5μl?Quick?T4DNA?Ligase，25℃放置10分鐘，取5μl加入50μl?Trans1感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘；

42℃熱激30秒，立即置于冰上2分鐘；加入250μl?LB培養(yǎng)基，200rpm，37℃孵育1小時(shí)；取200μl菌液涂在含有卡那霉素（終濃度為50ug/ml）的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽性單菌落，將陽性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質(zhì)粒。