[發(fā)明專利]氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸、氨基酸的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310652741.3
• 申請(qǐng)日: 2013-12-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103675183A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳東;梁遠(yuǎn)雄
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 柳州聯(lián)海科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/88
• 分類號(hào): G01N30/88
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 鄧曉安

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸、氨基酸的方法。

背景技術(shù)

在利用氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)有機(jī)酸、氨基酸代謝物方面，目前已有相關(guān)技術(shù)報(bào)道，如專利201210046953.2，公布了一種氣相色譜－質(zhì)譜檢測(cè)尿有機(jī)酸的方法，包括如下步驟：（1）對(duì)待檢尿液樣本完成尿酶處理；（2）加入內(nèi)標(biāo)品，采用冷凍乙醇進(jìn)行沉淀蛋白的處理，將樣本吹干；（3）對(duì)上述樣本進(jìn)行甲基硅烷化衍生處理；（4）采用上述1-3的步驟處理標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸，得到標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸樣本；（5）采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸樣本和待檢尿液樣本進(jìn)行檢測(cè)；（6）以標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸樣本的檢測(cè)結(jié)果作為參比曲線，用常規(guī)算法對(duì)待檢尿液樣本的有機(jī)酸進(jìn)行定量。該專利發(fā)明主要應(yīng)用領(lǐng)域?yàn)槟驑訖z測(cè)，且該檢測(cè)方法僅局限于有機(jī)酸代謝物的檢測(cè)，不能同時(shí)檢測(cè)有機(jī)酸、氨基酸兩類代謝物。

對(duì)于微生物胞內(nèi)、胞外代謝物的檢測(cè)研究，可以揭示微生物在發(fā)酵條件下的代謝規(guī)律，尤其是發(fā)酵條件對(duì)于微生物目標(biāo)產(chǎn)物的影響規(guī)律。掌握微生物的代謝規(guī)律可以不僅有利的促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量提升，而且可確定菌體內(nèi)的代謝通量分布，進(jìn)而利用基因工程手段實(shí)現(xiàn)菌體內(nèi)代謝途徑的優(yōu)化與重構(gòu)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物高效生物合成。

目前對(duì)于發(fā)酵液中的代謝物分析檢測(cè)方法局限用于特定某類物質(zhì)，不可實(shí)現(xiàn)多類代謝物同時(shí)檢測(cè)。由于發(fā)酵液中各成分含量復(fù)雜多樣，對(duì)于樣品的處理方法很關(guān)鍵，目前還沒(méi)有相關(guān)發(fā)酵液中、細(xì)胞外代謝物的系統(tǒng)處理檢測(cè)方法，使得開(kāi)發(fā)一種更為靈敏的、廣譜的、通用的發(fā)酵代謝物檢測(cè)方法，鑒定各種譜峰對(duì)映的化合物結(jié)構(gòu)，以及與其它虛擬模型的整合，成為微生物代謝組研究的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸、氨基酸的方法，彌補(bǔ)目前在微生物發(fā)酵中對(duì)代謝物系統(tǒng)檢測(cè)方法的空白，克服現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)干擾因素很多、操作繁瑣、測(cè)試成本高、靈敏度低、檢測(cè)范圍窄等缺點(diǎn)。

本發(fā)明的方案是通過(guò)這樣實(shí)現(xiàn)的：一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸、氨基酸的方法，檢測(cè)方法步驟包括：

（1）取發(fā)酵液，高速離心，分別收集菌體和上清液Ⅰ；

（2）發(fā)酵液樣品制備：取60~350ul步驟1）得到的上清液Ⅰ，在清液Ⅰ中加入乙腈除去蛋白，上清液Ⅰ與乙腈體積比為1:0.5~1.5，渦旋振蕩，再離心收集上清液Ⅲ，加入內(nèi)標(biāo)物核糖醇溶液，上清液Ⅲ體積與內(nèi)標(biāo)物核糖醇重量比例為50~300ul：20μg，室溫真空烘干，得到細(xì)胞外液樣品Ⅱ；

（3）樣品衍生：在步驟2）得到的樣品Ⅱ中，分別加入50~150ul糖衍生劑，恒溫放置1.5~4h，再分別加入50~150ul氨基酸衍生劑，恒溫放置過(guò)夜，衍生完畢，離心衍生后的樣品Ⅱ，收集上清得到待測(cè)胞內(nèi)樣品Ⅱ；

（4）利用氣相色譜-質(zhì)譜對(duì)步驟3）得到的待測(cè)胞內(nèi)樣品Ⅱ，進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)采集。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述菌體其取樣量為用冷甲醇溶解后生物量干重達(dá)0.2~1.0g/ml；所述的冷甲醇為經(jīng)過(guò)冷浴槽預(yù)冷至-40℃；所述低溫萃取為-40℃至-50℃下萃取2~7h。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述糖衍生劑為0.1~0.3mg甲氧胺鹽酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得；所述氨基酸衍生劑為50~200ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件為：氣相色譜：色譜柱為30?m×0.25?mm的HP-5MS或者DB-5MS毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度300℃，檢測(cè)器溫度250℃，柱箱升溫程序平衡時(shí)間3?min→80℃維持1min?→2℃/min升溫至100℃→15℃/min升溫至220℃→30℃/min升溫至300℃→300℃維持3?min，進(jìn)樣體積1μL；質(zhì)譜：離子源EI，檢測(cè)器為四級(jí)桿，電離能70?eV，離子源表面溫度280℃。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，該方法應(yīng)用于檢測(cè)酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵液中的有機(jī)酸、氨基酸。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，其特征在于，所述有機(jī)酸為琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、丙酮酸、富馬酸；所述氨基酸為谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、丙氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天門冬氨酸、天門冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸。