[發明專利]利用單細胞菌體蛋白提取泛素及類泛素的方法

無效

• 申請號: 201310652572.3
• 申請日: 2013-12-03
• 公開（公告）號: CN103695507A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 趙金梁;趙發
• 申請（專利權）人: 天津替代醫學科技有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/39;C07K14/38;C07K14/335;C07K1/34
• 代理公司: 天津才智專利商標代理有限公司 12108
• 代理人: 王顕

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，特別涉及一種利用單細胞菌體蛋白提取泛素及類泛素的方法。

背景技術

泛素蛋白由76個氨基酸殘基組成，其分子量約為8.5kDa，以“泛素”為名是因為它在生物體中廣泛存在。泛素一個最主要的功能就是幫助清理細胞，標記需要分解掉的蛋白質，將受損、老化、凋零的細胞及蛋白質分解，以實現蛋白的再循環利用，對病變、損傷、衰老的細胞進行定位清除，使其被水解。

隨著社會進步和經濟發展，人們的生活節奏不斷加快，對于保健品和保養品的需求也日益增多。雖然高科技醫學治療技術、診斷技術日新月異，但是卻無法阻擋慢性病大量發生且快速蔓延的趨勢。目前尚未發現有效藥物或手術能夠預防、消除甚至治療任何慢性病。

通過泛素補充機體本身存在的再生修復因子，利用幾乎所有組織器官中均存在的干細胞的自動再生修復功能，很方便的用自身生產的“原配件”自動修復或再造因任何病變、損傷而衰老的細胞和組織。進行自再生修復和復原，達到對病變、損傷、衰老細胞進行定位的新陳代謝，使生命環境復原。因此泛素及類泛素食品有助于治療慢性疾病。

自1975年泛素在小牛胰臟中分離出來，目前國內外已對泛素及類泛素作用的機理、純化、應用作了大量的研究。但是現在尚未見到利用發酵獲得菌體蛋白提取生產泛素及類泛素的方法。

發明內容

為了解決現有泛素、類泛素生產過程復雜、生產價格昂貴的技術問題，本發明提供了一種利用單細胞菌體蛋白提取泛素及類泛素的方法，該方法選用原料價格低廉，有效降低生產價格，且制備過程簡單，可用于大規模生產。

為此，本發明技術方案如下：

一種利用單細胞菌體蛋白提取泛素及類泛素的方法，包括如下步驟：

1）將菌株接種到完全培養基的斜面上，在28～37℃條件下培養2～5天，制成斜面種子；

2）將斜面種子上的單菌落或孢子在無菌條件下接種到搖瓶中，在28～37℃條件下培養12～48h，再將搖瓶內培養好的菌液轉接到一級種子培養基中，在28～37℃條件下培養12～48h，得到一級種子；

3）按照發酵罐體積的1～3%取一級種子接種于發酵罐內，在28～37℃、起始pH=5.0～7.5的條件下進行培養，至菌體濃度達到最大值時停止發酵，得到一次發酵營養液；

4）將所述一次發酵營養液用孔徑0.01～1μm的陶瓷膜在0.05MPa～0.5MPa條件下進行過濾，收集第一截留物得到菌體，或者用離心機在4000～8000rpm條件下離心分離15～30min，收集沉淀得到菌體，再將所述菌體用無菌水洗滌2～3次；再進行離心分離，得到一級菌體；

5）將所述一級菌體置于磷酸鹽緩沖液中制得菌懸液，向菌懸液中加入0.5～3wt%的酶，充分混合后靜置0.5～2h，然后將其放入高壓勻漿機，在85～95MPa條件下多次勻漿，得到細胞破碎混合液；

6）將細胞破碎混合液用0.01～1μm的陶瓷膜在0.05～0.5MPa條件下過濾，收集濾過液得到粗蛋白液；或者用離心機在4000～8000rpm條件下離心分離15～30min，收集上清液得到粗蛋白液；

7）將所述粗蛋白液利用5～20wt%的蔗糖梯度溶液在60000～80000rpm條件下進行4～6h梯度離心，收集濃度為5～10wt%蔗糖溶液帶內的沉淀物即為所述泛素及類泛素；或者用截留分子量為14萬的超濾膜過濾所述粗蛋白液，收集濾過液并將其用截留分子量為4000～12000的中性超濾膜過濾，收集第二截留物即得所述泛素及類泛素；

步驟1）中所述菌株為大腸桿菌、醋酸桿菌、假單胞菌、短桿菌、棒桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、丙酸桿菌、枯草芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、果糖芽孢桿菌、芽孢梭菌、微球菌、鏈球菌、明串珠菌、或對人體無致病作用的霉菌、放線菌和酵母菌，或原生生物中的藻類。

一種利用單細胞菌體蛋白提取泛素及類泛素粉的方法，包括如下步驟：

1）將菌株接種到完全培養基的斜面上，在28～37℃條件下培養2～5天，制成斜面種子；

2）將斜面種子上的單菌落或孢子在無菌條件下接種到搖瓶中，在28～37℃條件下培養12～48h，再將搖瓶內培養好的菌液轉接到一級種子培養基中，在28～37℃條件下培養12～48h，得到一級種子；

3）按照發酵罐體積的1～3%取一級種子接種于發酵罐內，在28～37℃、起始pH=5.0～7.5的條件下進行培養，至菌體濃度達到最大值時停止發酵，得到一次發酵營養液；