[發(fā)明專利]利用單細(xì)胞菌體蛋白提取泛素及類泛素的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310652572.3
• 申請日: 2013-12-03
• 公開（公告）號: CN103695507A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙金梁;趙發(fā)
• 申請（專利權(quán)）人: 天津替代醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/39;C07K14/38;C07K14/335;C07K1/34
• 代理公司: 天津才智專利商標(biāo)代理有限公司 12108
• 代理人: 王顕

1.一種利用單細(xì)胞菌體蛋白提取泛素及類泛素的方法，其特征在于：包括如下步驟：

1）將菌株接種到完全培養(yǎng)基的斜面上，在28～37℃條件下培養(yǎng)2～5天，制成斜面種子；

2）將斜面種子上的單菌落或孢子在無菌條件下接種到搖瓶中，在28～37℃條件下培養(yǎng)12～48h，再將搖瓶內(nèi)培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)接到一級種子培養(yǎng)基中，在28～37℃條件下培養(yǎng)12～48h，得到一級種子；

3）按照發(fā)酵罐體積的1～3%取一級種子接種于發(fā)酵罐內(nèi)，在28～37℃、起始pH=5.0～7.5的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，至菌體濃度達(dá)到最大值時停止發(fā)酵，得到一次發(fā)酵營養(yǎng)液；

4）將所述一次發(fā)酵營養(yǎng)液用孔徑0.01～1μm的陶瓷膜在0.05MPa～0.5MPa條件下進(jìn)行過濾，收集第一截留物得到菌體，或者用離心機在4000～8000rpm條件下離心分離15～30min，收集沉淀得到菌體，再將所述菌體用無菌水洗滌2～3次；再進(jìn)行離心分離，得到一級菌體；

5）將所述一級菌體置于磷酸鹽緩沖液中制得菌懸液，向菌懸液中加入0.5～3wt%的酶，充分混合后靜置0.5～2h，然后將其放入高壓勻漿機，在85～95MPa條件下多次勻漿，得到細(xì)胞破碎混合液；

6）將細(xì)胞破碎混合液用0.01～1μm的陶瓷膜在0.05～0.5MPa條件下過濾，收集濾過液得到粗蛋白液；或者用離心機在4000～8000rpm條件下離心分離15～30min，收集上清液得到粗蛋白液；

7）將所述粗蛋白液利用5～20wt%的蔗糖梯度溶液在60000～80000rpm條件下進(jìn)行4～6h梯度離心，收集濃度為5～10wt%蔗糖溶液帶內(nèi)的沉淀物即為所述泛素及類泛素；或者用截留分子量為14萬的超濾膜過濾所述粗蛋白液，收集濾過液并將其用截留分子量為4000～12000的中性超濾膜過濾，收集第二截留物即得所述泛素及類泛素；

步驟1）中所述菌株為大腸桿菌、醋酸桿菌、假單胞菌、短桿菌、棒桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、丙酸桿菌、枯草芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、果糖芽孢桿菌、芽孢梭菌、微球菌、鏈球菌、明串珠菌或?qū)θ梭w無致病作用的霉菌、放線菌和酵母菌，或原生生物中的藻類。

2.一種利用單細(xì)胞菌體蛋白提取泛素及類泛素粉的方法，其特征在于：包括如下步驟：

1）將菌株接種到完全培養(yǎng)基的斜面上，在28～37℃條件下培養(yǎng)2～5天，制成斜面種子；

2）將斜面種子上的單菌落或孢子在無菌條件下接種到搖瓶中，在28～37℃條件下培養(yǎng)12～48h，再將搖瓶內(nèi)培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)接到一級種子培養(yǎng)基中，在28～37℃條件下培養(yǎng)12～48h，得到一級種子；

3）按照發(fā)酵罐體積的1～3%取一級種子接種于發(fā)酵罐內(nèi)，在28～37℃、起始pH=5.0～7.5的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，至菌體濃度達(dá)到最大值時停止發(fā)酵，得到一次發(fā)酵營養(yǎng)液；

4）將所述一次發(fā)酵營養(yǎng)液用孔徑0.01～1μm的陶瓷膜在0.05MPa～0.5MPa條件下進(jìn)行過濾，收集第一截留物得到菌體，或者用離心機在4000～8000rpm條件下離心分離15～30min，收集沉淀得到菌體，再將所述菌體用無菌水洗滌2～3次；再進(jìn)行離心分離，得到一級菌體；

5）將所述一級菌體置于磷酸鹽緩沖液中制得菌懸液，向菌懸液中加入0.5～3wt%的酶，充分混合后靜置0.5～2h，然后將其放入高壓勻漿機，在85～95MPa條件下多次勻漿，得到細(xì)胞破碎混合液；

6）將細(xì)胞破碎混合液用0.01～1μm的陶瓷膜在0.05～0.5MPa條件下過濾，收集濾過液得到粗蛋白液；或者用離心機在4000～8000rpm條件下離心分離15～30min，收集上清液得到粗蛋白液；

7）將所述粗蛋白液利用5～20wt%的蔗糖梯度溶液在60000～80000rpm條件下進(jìn)行4～6h梯度離心，收集濃度為5～10wt%蔗糖溶液帶內(nèi)的沉淀物即為所述泛素及類泛素；或者用截留分子量為14萬的超濾膜過濾所述粗蛋白液，收集濾過液并將其用截留分子量為4000～12000的中性超濾膜過濾，收集第二截留物即得所述泛素及類泛素；

8）將所述泛素及類泛素置于噴霧干燥機內(nèi)，在進(jìn)口溫度120～150℃、出口溫度62～73℃條件下進(jìn)行噴霧干燥，得到所述泛素及類泛素粉；

步驟1）中所述菌株為大腸桿菌、醋酸桿菌、假單胞菌、短桿菌、棒桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、丙酸桿菌、枯草芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、果糖芽孢桿菌、芽孢梭菌、微球菌、鏈球菌、明串珠菌或?qū)θ梭w無致病作用的霉菌、放線菌和酵母菌，或原生生物中的藻類。