[發(fā)明專利]一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310651763.8
• 申請日: 2013-12-05
• 公開（公告）號: CN103667340A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邱法展;張祖新;杜鄧襄;張小波;張方東;鄭用璉
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于玉米生物技術(shù)育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的構(gòu)建方法，通過基因槍介導的轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)入抗蟲基因，對轉(zhuǎn)基因后代進行了一系列基因純合鑒定、表達驗證，農(nóng)藝性狀篩選、抗性鑒定，遺傳穩(wěn)定性研究；并通過回交和分子標記輔助選擇的方法將抗蟲基因?qū)胗N材料中獲得了高抗玉米螟的優(yōu)良玉米種質(zhì)材料。

背景技術(shù)

玉米（Zea?mays?L.），學名玉蜀黍，是重要的糧食作物，也是重要的飼料和工業(yè)原料，在國民生計和經(jīng)濟建設(shè)中起著至關(guān)重要的作用。世界范圍內(nèi)玉米蟲害約350種，其中以蛀莖性和食葉性的鱗翅目害蟲玉米螟分布最為廣泛，危害最重，是世界性的重要玉米蟲害，嚴重影響著玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。世界上每年因為玉米螟危害造成10%以上的減產(chǎn)和經(jīng)濟損失，大發(fā)生年甚至絕收。因此有效地防治蟲害對玉米生產(chǎn)具有重要的意義。玉米材料中缺乏有效的天然抗性基因，很難利用傳統(tǒng)的育種技術(shù)手段篩選得到具有優(yōu)良抗蟲性的玉米材料，傳統(tǒng)的害蟲防治措施主要為化學防治，但是化學農(nóng)藥具有成本高、環(huán)境污染、易殘留、會毒害有益昆蟲和害蟲天敵等弊端不適宜長期使用。

植物基因工程的興起與發(fā)展，為玉米病蟲害的防治提供了一條嶄新的思路。利用基因工程手段培育抗蟲新品種具有不污染環(huán)境、對害蟲的殺蟲性具有專一性、育種周期短、育種和栽培成本低等優(yōu)點。現(xiàn)在應用基因工程手段培育的抗蟲材料數(shù)量直線上升，幾乎涵蓋了所有的重要農(nóng)作物。在眾多的抗蟲基因中，Bt殺蟲蛋白基因是一類作用機理研究比較清楚，市場應用最廣泛和最有潛力的殺蟲蛋白。自從1993世界上第一例成功的轉(zhuǎn)cry1Ab基因抗蟲玉米出現(xiàn)，抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米發(fā)展迅速，直到1996年，表達cry1Ab基因的轉(zhuǎn)Bt基因玉米被批準商業(yè)應用于控制歐洲玉米螟危害。隨后，攜帶來自于蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米越來越多地被用來控制玉米生產(chǎn)中主要的鱗翅目害蟲。具有Cry1Ab蛋白表達的玉米種質(zhì)用來進行玉米的雜交已經(jīng)被證明是一個可以減少農(nóng)藥使用，并減少對環(huán)境和人類潛在危害的有效管理措施。

隨著國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因植物研究的快速發(fā)展，有關(guān)Bt基因的專利覆蓋范圍越來越廣，而且近年來針對中國農(nóng)業(yè)微生物和植物生物技術(shù)方面的飛速發(fā)展，高技術(shù)的競爭日趨激烈；獲得我國自主知識產(chǎn)權(quán)的攜帶新型自主產(chǎn)權(quán)的Bt殺蟲基因的優(yōu)良種質(zhì)資源，并盡快用于新一代轉(zhuǎn)基因抗蟲作物育種，為我國轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)保障成為極為緊迫的任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供了一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的構(gòu)建方法，通過該方法可獲得一種玉米抗蟲轉(zhuǎn)基因新材料，命名為ZmKc，經(jīng)過各種分子生物學鑒定與功能鑒定和田間試驗以及分子標記輔助選擇育種，獲得的新的攜帶抗蟲轉(zhuǎn)基因的新材料全生育期表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗性，農(nóng)藝性狀優(yōu)良，遺傳穩(wěn)定，適用于新型抗蟲玉米材料的生產(chǎn)并可以有效的在玉米分子育種中廣泛應用。

為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

本發(fā)明使用的為優(yōu)化后的cry1C基因，即cry1C*，其序列為SEQ?ID?NO.1所示。胚性玉米愈傷組織（引自華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳育種國家重點實驗室，參照Plant?Transformation?Facility（http://agron-www.agron.iastate.edu/ptf/）作為轉(zhuǎn)化受體材料。使用基因槍介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將攜帶外源基因的轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA3300金粉包裹后轟擊玉米胚性愈傷組織完成轉(zhuǎn)化，經(jīng)過組織培養(yǎng)、篩選、分化后進行煉苗、移栽得到轉(zhuǎn)化單株。對轉(zhuǎn)化材料及其后代進行一系列分子生物學實驗檢測和田間表型與主要農(nóng)藝性狀的測定，獲得了一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米新材料，通過回交和分子標記輔助選擇的方法驗證了該抗性基因在不同遺傳背景中的優(yōu)良表現(xiàn)，為后續(xù)抗螟蟲玉米新品種的培育提供了優(yōu)良的種質(zhì)資源。

一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的構(gòu)建方法，其步驟如下：

（1）按照常規(guī)方案制備胚性玉米愈傷組織。

（2）轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建：

pCAMBIA3300載體用BamH?I和Hind?III進行雙酶切消化并重新連接cry1C*基因獲得目的載體。然后使用限制性內(nèi)切酶samI切下載體上的潮霉素抗性基因，使用連接酶將帶有samI酶接頭的草丁膦抗性基因bar基因替換，獲得轉(zhuǎn)基因載體。

（3）利用基因槍介導轉(zhuǎn)化的方法，將包裹有目的基因載體的金粉轟擊高滲培養(yǎng)后的胚性愈傷組織。基因槍轟擊后恢復培養(yǎng)7-10天后轉(zhuǎn)入含有2mg/L雙丙氨膦的篩選培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)2-3輪，每輪20-30天。篩選后將具有除草劑抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基分化成苗，得到一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米單株。