[發明專利]鏈霉菌幾丁質酶的分離純化方法

在審

• 申請號: 201310650637.0
• 申請日: 2013-12-06
• 公開（公告）號: CN103667218A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 段升華
• 申請（專利權）人: 中山奈德生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42
• 代理公司: 中山市銘洋專利商標事務所(普通合伙) 44286
• 代理人: 鄒常友

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體來說是一種鏈霉菌幾丁質酶的分離純化方法。

背景技術

鏈霉菌，其基內菌絲多分枝，一般橫隔稀疏，很少斷裂，常產生各種水溶性或脂溶性的色素；氣生菌絲比基內菌絲稍粗，為外鞘所包，氣生菌絲部分分化成直形、柔曲、鉤環狀至松敞或緊密螺旋形的孢子絲，時常含50個左右的孢子，短者含5～10個孢子；孢子為節孢子,由菌絲斷裂而成，有的脫去外鞘,有的攜帶外鞘或殘余,外鞘決定孢子的表面結構；DNA中的G+C克分子含量為69～76％，因許多種是抗生素的產生菌而且產生抗生素的種類最多而著名（如鏈霉素）。

幾丁質酶作為一種抗菌蛋白是生防菌抑制病原真菌的重要機制之一。合適的培養方法與微生物產幾丁質酶密切相關。因此人們在提高微生物的產幾丁質酶量時，必須對發酵條件進行適當調控，以確定該菌最適的產酶條件，為更強抑制真菌的孢子萌發和菌絲生長，激發植物啟動防御反應，使植物產生更多的防御蛋白，增強植物的抗性提供基礎。

發明內容

本發明的目的是提供一種鏈霉菌幾丁質酶的分離純化方法，，特異性高，工藝簡單，蛋白質不易失活，純化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推廣應用價值。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種鏈霉菌幾丁質酶的分離純化方法，包括如下步驟：

（1）粗酶液的制備；

（2）離子交換層析；

（3）凝膠過濾。

進一步的：所述粗酶液的制備：用優化試驗篩選出的培養基培養鏈霉菌，在幾丁質酶活性達最高時取發酵液離心，上清液用真空抽濾，除去雜質收集濾液，向濾液中加入固體硫酸銨至飽和度為60%，4℃靜置過夜，再次離心收集沉淀，用緩沖液溶解沉淀，離心溶解液除去不溶物體，上清液裝于透析袋，經pH6.5?0.01～0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液透析后，再用聚乙二醇濃縮得到粗酶液；

進一步的：所述培養基為：2%（w/V）的膠體幾丁質100ml/L，黃豆餅粉0.4wt%，K₂HPO₄1.0(g/L)，KH₂PO₄0.6(g/L)。

進一步的：所述離心條件為4℃，轉速8500～12000?rpm，時間10～15?min。

進一步的：所述離子交換層析:?粗酶液經過聚乙二醇PEG20000?濃縮后，用0.01-0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液平衡過夜，上樣于充分平衡后的DEAE?A-52?陰離子交換層析柱，用0.01～0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白，在收集洗脫液的過程中，逐管用紫外分光光度計檢驗雜蛋白的洗脫情況，當基線開始走平后，改用含0～1mol/L?NaCl?的0.01～0.03mol/L磷酸鹽緩沖液進行連續洗脫,?收集洗脫液。

進一步的：所所述洗脫條件為：流速35mL/h?；5mL/管。

進一步的：所述凝膠過濾：用pH6.5?0.01～0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液充分平衡的Sephadex?G-75凝膠過濾層析柱，上樣后，再用相同的緩沖液進行洗脫，收集有酶活性的部份。

進一步的：所述洗脫條件為：流速15-25?mL/h?，5mL/管。

本發明的有益技術效果是：本發明方法特異性高，工藝簡單，蛋白質不易失活，純化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推廣應用價值。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

實施實例一

（1）用優化試驗篩選出的培養基（2%（w/V）的膠體幾丁質100ml/L、黃豆餅粉0.4wt%、K₂HPO₄1.0(g/L)和KH₂PO₄0.6(g/L)）培養菌株，在幾丁質酶活性達最高時取發酵液，8500rpm?離心10min，上清液用真空抽濾，收集濾液。向濾液中加入固體硫酸銨至飽和度為60%，4℃靜置過夜。12000?rpm、4℃離心15?min收集沉淀，用適量0.01mol/L的緩沖液溶解沉淀。12000?rpm、4℃離心15?min?除去不溶物體，上清液裝于透析袋，經0.01?mol/L?的磷酸鹽緩沖液(pH6.5)透析后，再用聚乙二醇濃縮得到粗酶液。