[發明專利]一種基于3D培養體系的擴增造血干細胞的方法

有效

• 申請號: 201310648974.6
• 申請日: 2013-12-06
• 公開（公告）號: CN103740644A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 曾憲卓
• 申請（專利權）人: 曾憲卓
• 主分類號: C12N5/0789
• 分類號: C12N5/0789
• 代理公司: 北京東正專利代理事務所(普通合伙) 11312
• 代理人: 劉瑜冬

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及到一種基于3D培養體系擴增造血干細胞的方法。

背景技術

造血干細胞在治療白血病、惡性腫瘤、重癥非惡性血液系統疾病以及某些遺傳性疾病中有廣泛的應用，是因為這類細胞具有自我更新、高度增殖、多向分化等能力，這也預示著體外擴增造血干細胞在臨床應用上有著廣闊的前景。

目前，在造血干細胞的體外培養中，首先是對骨髓、臍帶血或者外周血進行密度梯度離心提取單個核細胞，接著進行磁珠分選得到CD34+細胞，然后將造血干細胞放入培養體系中擴增培養。最常使用的傳統2D培養，是將造血干細胞懸浮培養于培養瓶或培養板中，再添加血清替代物和多種生長因子，血清替代物由轉鐵蛋白和人胰島素等物質組成，生長因子包括干細胞因子(SCF)、FMS樣酪氨酸激酶-3配體(FL)、促紅細胞生成素(EPO)等。造血干細胞生長因子可調控造血干細胞的存活和增殖，在造血干細胞的培養中是必不可少的部分。

體內的造血干細胞主要存在于骨髓中，約占骨髓細胞總數的0.01％，在一般狀態下造血干細胞數目保持不變，但是當有造血需要時，造血干細胞會進行顯著的擴增，不同于體外培養，體內的造血干細胞在擴增過程中能夠維持自我更新能力，因此體內細胞生長的微環境對于造血干細胞自我更新、擴增具有重要的作用。已有研究表明建立一種3D培養體系對于提高造血干細胞的體外擴增倍數，延長體外培養時間和維持自我更新能力有顯著效果。Matthias?P.Lutolf成功合成了一種聚乙二醇水凝膠微孔平臺用于維持造血干細胞的自我更新和造血系統重塑能力。

生理性乏氧對造血干細胞的生物特性和功能具有保護作用。低氧環境下，體外培養的造血干細胞有更好的集落形成能力，低氧環境可以刺激VEGF、BNIP3、CXCR4等基因的表達，從而通過細胞旁分泌來調節造血干細胞的增殖、凋亡和分化。低氧環境能使造血干細胞擴增更多的較原始的AC133+CD34+造血干細胞和有活性的CD34+造血干細胞，維持較多的干細胞處于G0/G1期，促進各系集落(BFU-E、CFU-GM等)的生長，更好地維持造血干細胞的遷徙能力，但是目前，對影響造血干細胞擴增的氧濃度尚未有系統的確切的研究結果。

傳統2D培養體系體外擴增造血干細胞的倍數約為10倍，擴增倍數不理想，且不能為細胞提供充足的生長空間和支持細胞間聯系的空間結構，使得造血干細胞迅速分化從而失去干細胞特性。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明公開了一種基于3D培養體系擴增造血干細胞的方法，該方法在培養體系中加入生物相容的支架，模擬體內骨髓造血干細胞生長的三維環境，為細胞提供充足的生長空間和支持細胞間聯系的空間結構，可增加細胞擴增的倍數，同時維持造血干細胞的表型，不易分化，保持造血干細胞的特性。

為達到上述目的，本發明所采用的技術方案為，本發明公開了一種基于3D培養體系的造血干細胞擴增方法，方法包括如下步驟：(1)將血液中分離出的造血干細胞懸液置入復合培養基中培養：復合培養基包括無血清干細胞基礎培養基、SIFE生長因子、血清替代物、纖維蛋白凝膠；

(2)將(1)的復合培養基置入低氧培養箱中，低氧培養箱維持的氧濃度為3～20％。體內的造血干細胞主要存在于骨髓中，約占骨髓細胞總數的0.01％，在平時狀態下造血干細胞數目保持不變，但是當有造血需要時，造血干細胞會進行顯著的擴增，不同于體外培養，體內的造血干細胞擴增過程中能夠維持自我更新能力，因此體內細胞生長的微環境對于造血干細胞自我更新、擴增具有重要的作用，本發明中添加的纖維蛋白凝膠是一種高分子網絡體系，能吸收大量的水份，其結構與細胞外基質極為相似，能夠在體外模擬體內造血干細胞的生長微環境，從而為細胞提供充足的生長空間和支持細胞間聯系的空間結構，而且纖維蛋白凝膠生理、無菌、無毒且具有良好的生物相容性，可通過釋放β轉化因子和血小板衍生生長因子等來促進細胞粘附、增殖并分泌基質，能夠顯著增加細胞擴增倍數，同時維持造血干細胞的特性，防止其因分化而喪失干細胞的特性。