[發(fā)明專(zhuān)利]一種細(xì)胞內(nèi)表達(dá)花生過(guò)敏原的重組乳酸乳球菌及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310648469.1
• 申請(qǐng)日: 2013-12-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103642746A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張秋香;陳衛(wèi);任晟誠(chéng);王剛;田豐偉;劉小鳴;趙國(guó)忠;趙建新;張灝;郭敏
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12N15/74;A61K48/00;A61K39/35;A61P37/08;C12R1/01
• 代理公司: 北京君智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11305
• 代理人: 呂世靜

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及細(xì)胞內(nèi)表達(dá)花生過(guò)敏原Arah2的重組乳酸乳球菌菌株，其構(gòu)建方法及應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】

花生過(guò)敏是最嚴(yán)重而且常見(jiàn)的食物過(guò)敏反應(yīng)之一，具有發(fā)病快、致死率高及終生性等特點(diǎn)。近些年來(lái)，花生過(guò)敏的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)有逐年上升的趨勢(shì)。在美國(guó)，有1.1%的人口對(duì)花生過(guò)敏，其發(fā)病率在1997年至2002年間增長(zhǎng)了近一倍。誘導(dǎo)特異性口服耐受，即在一段時(shí)間內(nèi)通過(guò)給予患者逐漸增加劑量的過(guò)敏原以誘導(dǎo)患者對(duì)此種食物抗原產(chǎn)生免疫耐受的治療方法，是目前比較有效的花生過(guò)敏治療方法。

高純度過(guò)敏原的獲取是進(jìn)行免疫耐受性誘導(dǎo)的前提和基礎(chǔ)。花生過(guò)敏原共有11種，其中Arah2是一種分子量為17-19KDa的糖蛋白，可被超過(guò)90%的患者血清中IgE特異性識(shí)別，是目前研究最廣泛也是最重要的花生過(guò)敏原之一。近些年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使利用生物合成方法獲取高純度的過(guò)敏原成為可能。目前已有國(guó)內(nèi)外研究者利用不同表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)花生過(guò)敏原，如陶愛(ài)林等（2012）在專(zhuān)利《一種重組花生過(guò)敏原與突變體及其制備方法和應(yīng)用》中介紹了利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備一種重組花生過(guò)敏原與突變體的方法；Katrin?Lehmann等已成功利用大腸桿菌重組表達(dá)具有良好免疫原性的Arah2蛋白（Katrin?Lehmann,et?al.High-yield?expression?in?Escherichia?coli,purification,and?characterization?of?properly?folded?major?peanut?allergen?Arah2.Protein?Expression?and?Purification,2003,31:250–259）。但大腸桿菌可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類(lèi)繁多的內(nèi)毒素，且表達(dá)產(chǎn)物的后續(xù)純化成本高昂，限制了大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)的臨床應(yīng)用。

乳酸乳球菌長(zhǎng)期以來(lái)被廣泛應(yīng)用于酸奶、奶酪、泡菜等傳統(tǒng)食品的生產(chǎn)中，是公認(rèn)安全的微生物。利用乳酸乳球菌表達(dá)外源蛋白可無(wú)需純化連同菌體一起服用，同時(shí)利用乳酸乳球菌作為表達(dá)載體的黏膜疫苗可有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)和免疫耐受。因此，我們利用乳酸乳球菌（Lactococcus?lactis）作為粘膜疫苗呈遞載體，將花生過(guò)敏原Arah2在L.lactis細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，所構(gòu)建的重組乳酸乳球菌菌株在醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種細(xì)胞內(nèi)表達(dá)花生過(guò)敏原蛋白nArah2的重組乳酸乳球菌菌株及其構(gòu)建方法，該菌株是用含有經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的編碼花生過(guò)敏原蛋白nArah2的編碼基因的重組質(zhì)粒pNZ1轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌所獲得的，其中所使用的乳酸乳球菌可以是L.lactis?NZ9000。轉(zhuǎn)化后篩選所獲得的菌株為L(zhǎng).lactis?NZNH，該菌株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC）保藏，其保藏編號(hào)為CGMCC：8216。本發(fā)明還涉及所述重組乳酸乳球菌菌株的構(gòu)建方法，所述方法包括如下步驟：

a)對(duì)花生過(guò)敏原Arah2的天然基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化以得到優(yōu)化基因nArah2；b)利用優(yōu)化基因nArah2進(jìn)一步構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒；c)利用重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌并篩選鑒定獲取重組乳酸乳球菌菌株，其中所構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒是胞內(nèi)表達(dá)載體質(zhì)粒PNZ1，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PNZ1時(shí)包括以質(zhì)粒pUC57-nArah2為模板，利用引物Pra1F5'-CATGCCATGGGTCAACAATGGGAATTACAAG-3'和Pra1R：5'-CGGGGTACCTTAATAACGATCACGACCAC-3'對(duì)nArah2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，步驟c）中的轉(zhuǎn)化方法是電轉(zhuǎn)化。

本發(fā)明還涉及包含所述的重組乳酸乳球菌菌株的疫苗，所述疫苗可以是口服制劑，例如膠囊劑、錠劑、粉劑或顆粒劑等。

本發(fā)明還涉及所述的重組質(zhì)粒或重組乳酸乳球菌菌株在制備可用于治療花生過(guò)敏的乳酸乳球菌疫苗中的用途。

本發(fā)明中重組花生過(guò)敏原蛋白nArah2成功地在L.lactis?NZ9000細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胞內(nèi)表達(dá)方式的重組疫苗可以調(diào)節(jié)過(guò)敏性的系統(tǒng)免疫反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)Th2型免疫應(yīng)答向Th1型免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變。

因此，優(yōu)化的花生過(guò)敏原nArah2基因可以重組質(zhì)粒DNA疫苗的形式用于花生過(guò)敏的預(yù)防及治療；重組乳酸乳球菌菌株可以膠囊、錠劑、粉包、顆粒狀包裝的形式，作為一種新型的口服疫苗應(yīng)用于花生過(guò)敏的臨床預(yù)防及免疫治療。