[發明專利]小麥成熟胚愈傷組織基因槍遺傳轉化方法

有效

• 申請號: 201310648037.0
• 申請日: 2013-12-04
• 公開（公告）號: CN103710378A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 陳耀鋒;王麗;李春蓮
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 李鄭建

技術領域

本發明屬于農業生物技術領域，具體涉及一種小麥成熟胚愈傷組織基因槍遺傳轉化方法。

背景技術

小麥是重要的糧食作物之一，自1992年Vasil等將GUS/Bar基因導入小麥幼胚愈傷組織、通過轉化細胞的再生獲得首例轉基因小麥以來，轉基因小麥研究有了長足的發展，盡管小麥轉基因方法報道不少，但基因槍轉化（microprojectile?bombardment）仍然是小麥遺傳轉化最有效的技術。目前，小麥基因槍遺傳轉化的主要受體為發育13天左右的小麥幼胚誘導的愈傷組織，但這一重要外植體的來源受到小麥生長季節及時段的影響，應用上很不方便，小麥成熟胚主要來自于收獲或儲藏的小麥種子，其取材不受小麥生長季節和時段的影響，非常方便，但小麥成熟胚愈傷組織誘導及再生能力極差，影響了這一技術的應用，盡管目前通過培養條件和培養基的改進，是小麥成熟胚誘導的愈傷組織基本可以達到基因槍遺傳轉化的水平，但與幼胚愈傷組織相比，還有巨大差距。研究、探索小麥成熟胚高效離體培養、再生和轉化的條件，使其達到小麥幼胚愈傷組織誘導、再生和轉化的水平，可為小麥外源基因的遺傳轉化和應用建立重要的技術基礎。

發明內容

針對上述現有技術存在的缺陷或不足，本發明的目的在于，提供一種小麥成熟胚愈傷組織高效誘導、再生和轉化的方法，該方法主要通過小麥成熟胚培養的前處理、有機物的添加及培養、轉化技術過程的優化，獲得了與小麥幼胚愈傷組織誘導、再生和轉化效率相近的技術效果，克服小麥成熟胚愈傷組織誘導難、再生特性差、轉化效率低及轉化受體組織取材受生長季節、時段影響的缺陷。

為實現上述任務，本發明采用如下的技術解決方案：

一種小麥成熟胚愈傷組織基因槍遺傳轉化方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）成熟胚的選擇與預處理：

選取當年收獲或儲藏1年左右、籽粒飽滿的小麥種子，用無菌水沖洗2次，在無菌條件下，用質量分數為70%的酒精消毒5min，然后在濃度為0.1%的升汞溶液中浸泡種子15min，無菌水沖洗4次；

消毒后的小麥種子置10mg/L的噻二唑苯基脲（TDZ）溶液中于25℃室溫條件下預處理15h；

2）接種與愈傷組織的誘導：

預處理后的小麥種子用濃度為0.1%的升汞溶液再次消毒10min，無菌水洗4次，于無菌條件下剝取成熟胚，接種于成熟胚愈傷組織誘導培養基上誘導愈傷組織；

所述的小麥成熟胚愈傷組織誘導培養基以通用MS培養基為基準，添加以下物質：2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）：2.0mg/L，鹽酸硫胺素（VB1）：8.0mg/L，水解酪蛋白：500mg/L，L-天門冬酰胺：250mg/L，L-谷氨酰胺：200mg/L，蔗糖：15000mg/L，麥芽糖：15000mg/L，瓊脂：5000mg/L；

通用培養基MS的配方為：硝酸鉀（KNO₃）：1900mg/L，硝酸氨（NH₄NO₃）：1650mg/L，氯化鈣（CaCl₂·2H₂O）：440mg/L，硫酸鎂（MgSO₄·7H₂O）：370mg/L，磷酸二氫鉀（KH₂PO₄）：170mg/L，硫酸亞鐵（FeSO₄·7H₂O）：27.8mg/L，乙二酸四乙鈉（Na₂EDTA）：37.3mg/L，硫酸錳（MnSO₄·4H₂O）：22.3mg/L，硫酸鋅（ZnSO₄·7H₂O）：8.6mg/L，硼酸（H₃BO₃）：6.2mg/L，碘化鉀（KI）：0.83mg/L，鉬酸鈉（Na₂MoO₄·2H₂O）：0.25mg/L，硫酸銅（CuSO₄·5H₂O）：0.025mg/L，氯化鈷（CoCl₂·6H₂O）：0.025mg/L，肌醇100mg/L，鹽酸硫胺素：0.5mg/L，鹽酸吡哆鋅：0.5mg/L，煙酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L。

調整成熟胚愈傷組織誘導培養基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋（壓力：1.0kg／cm²）滅菌20分鐘；

3）高滲培養：