[發明專利]小麥成熟胚愈傷組織基因槍遺傳轉化方法

有效

• 申請號: 201310648037.0
• 申請日: 2013-12-04
• 公開（公告）號: CN103710378A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 陳耀鋒;王麗;李春蓮
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 李鄭建

1.一種小麥成熟胚愈傷組織基因槍遺傳轉化方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）成熟胚的選擇與預處理：

選取當年收獲或儲藏1年左右、籽粒飽滿的小麥種子，用無菌水沖洗2次，在無菌條件下，用質量分數為70%的酒精消毒5min，然后在濃度為0.1%的升汞溶液中浸泡種子15min，無菌水沖洗4次；

消毒后的小麥種子置10mg/L的噻二唑苯基脲（TDZ）溶液中于25℃室溫條件下預處理15h；

2）接種與愈傷組織的誘導：

預處理后的小麥種子用濃度為0.1%的升汞溶液再次消毒10min，無菌水洗4次，于無菌條件下剝取成熟胚，接種于成熟胚愈傷組織誘導培養基上誘導愈傷組織；

所述的小麥成熟胚愈傷組織誘導培養基以通用MS培養基為基準，添加以下物質：2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）：2.0mg/L，鹽酸硫胺素（VB1）：8.0mg/L，水解酪蛋白：500mg/L，L-天門冬酰胺：250mg/L，L-谷氨酰胺：200mg/L；蔗糖：15000mg/L，麥芽糖：15000mg/L，瓊脂：5000mg/L；

通用培養基MS的配方為：硝酸鉀（KNO₃）：1900mg/L，硝酸氨（NH₄NO₃）：1650mg/L，氯化鈣（CaCl₂·2H₂O）：440mg/L，硫酸鎂（MgSO₄·7H₂O）：370mg/L，磷酸二氫鉀（KH₂PO₄）：170mg/L，硫酸亞鐵（FeSO₄·7H₂O）：27.8mg/L，乙二酸四乙鈉（Na₂EDTA）：37.3mg/L，硫酸錳（MnSO₄·4H₂O）：22.3mg/L，硫酸鋅（ZnSO₄·7H₂O）：8.6mg/L，硼酸（H₃BO₃）：6.2mg/L，碘化鉀（KI）：0.83mg/L，鉬酸鈉（Na₂MoO₄·2H₂O）：0.25mg/L，硫酸銅（CuSO₄·5H₂O）：0.025mg/L，氯化鈷（CoCl₂·6H₂O）：0.025mg/L，肌醇100mg/L，鹽酸硫胺素：0.5mg/L，鹽酸吡哆鋅：0.5mg/L，煙酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L；

調整成熟胚愈傷組織誘導培養基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘；

3）高滲培養：

小麥成熟胚組織誘導培養5天后陸續產生成熟胚愈傷組織，挑選誘導12天、質地致密的成熟胚愈傷組織轉移到高滲培養基中，于20℃黑暗條件高滲培養6h；

所述的高滲培養基為上述小麥成熟胚愈傷組織誘導培養基中再附加0.2mol/L的甘露醇和0.2mol/L的山梨醇；

4）基因槍轟擊轉化：

經高滲處理后的成熟胚愈傷組織用常規的基因槍轉化方法進行轟擊轉化，基因槍轟擊參數為：金粉直徑1.0μm，阻擋網與轟擊材料之間的距離為9.0cm，可裂膜壓力為1100Pa，每槍金粉/DNA用量為1μg/60μg，每皿材料轟擊2次；

5）恢復培養：

基因槍轟擊后的成熟胚愈傷組織在上述高滲培養基上繼續暗培養18h后，將愈傷組織從高滲培養基轉移至恢復培養基中，于26℃暗培養13天；

所述的小麥成熟胚愈傷組織恢復培養基以通用MS培養基為基準，添加以下物質：2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）：1.5mg/L，6-呋喃基氨基嘌呤（KT）：0.5mg/L，水解酪蛋白：500mg/L，L-天門冬酰胺：250mg/L，L-谷氨酰胺：200mg/L，鹽酸硫胺素（VB1）：8.0mg/L，蔗糖：15000mg/L，麥芽糖：15000mg/L，瓊脂：5000mg/L；

調整小麥成熟胚愈傷組織恢復培養基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘；

6）抗性篩選：

恢復培養后的愈傷組織轉移到抗性篩選培養基上，于26℃、3000lx光照下進行抗性細胞篩選，所述抗性篩選培養基以通用MS培養基為基準，添加以下物質：2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）：1.0mg/L，6-呋喃基氨基嘌呤（KT）：0.5mg/L，α-萘乙酸（NAA）：0.01mg/L，水解酪蛋白：500mg/L，L-天門冬酰胺：250mg/L，L-谷氨酰胺：200mg/L，鹽酸硫胺素（VB1）：8.0mg/L，卡拉霉素：100mg/L，蔗糖：15000mg/L，麥芽糖：15000mg/L，瓊脂：5000mg/L；

調整抗性篩選培養基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘；

7）分化培養：

恢復及篩選培養后的成熟胚愈傷組織轉至分化培養基上進行分化培養；培養溫度為25～28℃，光照度3000lx，每天光照12h；篩選再生的成熟胚愈傷組織，并在分化培養基上分化出芽苗；

所述的分化培養基以通用培養基MS為基準，添加以下物質：6－呋喃基氨基嘌呤（KT）：2.0mg/L，α-萘乙酸（NAA）：0.01mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，鹽酸硫胺素（VB1）：8.0mg/L，蔗糖：15000mg/L，麥芽糖：15000mg/L，瓊脂：5000mg/L；

調整分化培養基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力：1.0kg／cm²)滅菌20分鐘；

8）壯苗、生根培養：

待成熟胚愈傷組織分化的芽苗長至2～3片葉時轉移到生根、壯苗培養基上，于25℃、3000Lx光照條件下進行壯苗、生根培養；

所述的生根、壯苗培養基以通用培養基MS為基準，且將MS通用培養的無機鹽濃度降低一半，其中添加α－奈乙酸（NAA）0.5mg/L，蔗糖：30000mg/L，瓊脂：5000mg/L；

調整壯苗、生根培養基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘；

9）移植：

在生根、培壯苗養基上，生長健壯的成熟胚愈傷組織再生植株及時移栽到營養缽中，于15℃、3000Lx光照條件下緩苗，待完全緩苗且進一步生長10天后，在3-4℃低溫春化條件下處理20天，即得到轉化的轉基因株；

10）分子檢測并篩選：

用常規的分子檢測技術對轉化的轉基因的抗性個體進行分子檢測。