[發明專利]一種口服重組酵母及其介導的靶向腸道DC呈遞shRNA的應用

有效

• 申請號: 201310647359.3
• 申請日: 2013-12-02
• 公開（公告）號: CN103695327A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 張智英;張龍;邵斯旻;徐坤;李欣憶;徐華榮
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N1/18
• 分類號: C12N1/18;A61K48/00;A61P35/00;C12R1/865
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

技術領域

本發明屬于免疫學和基因工程技術領域，涉及一種口服重組酵母及其介導的靶向腸道DC呈遞shRNA的應用。

背景技術

基因治療(Gene?Therapy)是指應用基因工程技術將正常基因引入患者細胞內，以糾正致病基因的缺陷而根治疾病。糾正的途徑既可以是修復有缺陷的基因，也可以是按需求調控異常基因的表達，從而實現對缺陷基因的治療。常用的基因治療分為兩類，一類為基因修正和基因置換，即基因打靶技術將外源正常的基因在特定的部位進行重組，從而使缺陷基因在原位特異性修復。另一類為基因增強和基因抑制，即在不敲除異常基因的情況下，通過導入外源基因使其表達正常產物，從而補償缺陷基因等的功能；或特異阻斷某些基因的轉錄或翻譯，從而抑制基因的表達，實現基因治療。

RNA干擾（RNA?interference）是普遍存在于真核生物細胞內的一種可以高特異性的抑制靶基因表達的自然現象。這種基因沉默機制往往使用siRNA(small?interfering?RNA)或shRNA(short?hairpin?RNA)來實現。目前已經有超過30種臨床試驗使用21種不同的siRNA或者shRNA來進行基因治療。由于使用RNAi技術一方面可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，具有較高的特異性和高效性，另外由于其發生于除原核生物以外的所有真核生物細胞內，只降解與之序列相應的單個內源基因的mRNA，具有一定的安全性，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。

shRNA作為siRNA的前體通常使用病毒、細菌兩種工具進行傳遞，一般根據不同的應用選擇不同的運載工具。目前使用shRNA活體治療采用的方法是先在體外利用細菌或者病毒將shRNA傳遞到靶細胞中，然后將修飾的靶細胞重新注入患者體內，這種方式耗時，成功率低，風險大。因此亟需尋找一種安全有效的shRNA傳遞工具，將shRNA干擾技術安全、廣泛的應用與基因治療領域。

樹突狀細胞（Dendritic?cells,DC）是機體內功能最強的抗原呈遞細胞（Antigen?presenting?cells,APC），能夠高效地攝取、加工處理和呈遞抗原，處于調控和維持免疫應答的中心環節，是腫瘤細胞免疫治療的重要組成部分。傳統的DC細胞治療通過采用病人自體的單核細胞在體外培養誘導生成DC，然后負載相應的腫瘤抗原，制成負載腫瘤抗原的DC，再將這些DC細胞注入體內后刺激體內的腫瘤殺傷性淋巴細胞增殖，發揮腫瘤監視作用和腫瘤殺傷作用，達到消滅腫瘤的目的，但這種方式操作繁瑣、耗時長，費用昂貴等特點，因此亟需尋找一種能夠快速、安全并能活體治療DC細胞的方式。

釀酒酵母（Saccharomyces?cerevisiae）作為普遍公認的安全菌被廣泛應用于食物、飲料加工等行業，與我們的生活息息相關。釀酒酵母可以通過口服的方式被活體食用，方便安全。和細菌相比，釀酒酵母可以有效的抵抗抗生素作用，同時還可以高效的存活于活體動物的胃腸道環境而不被降解。

發明內容

本發明解決的問題在于提供一種口服重組酵母及其介導的靶向腸道DC呈遞shRNA的應用，通過基因工程發酵酵母疫苗向活體動物腸道DC細胞靶向遞呈shRNA干擾載體，可用于DC細胞的治療。

本發明是通過以下技術方案來實現：

一種口服重組酵母，以酵母菌株作為宿主細胞，宿主細胞中轉染有shRNA干擾載體，該shRNA干擾載體上設有hU6啟動子-shRNA-miR30的元件排列。

所述的shRNA干擾載體上設有hU6-shRNA-miR30的元件排列，其中shRNA的序列為SEQ.ID.NO.1～SEQ.ID.NO.3所示的一種或幾種。

所述的hU6的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，miR30的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。

所述的shRNA干擾載體為JMB84-hU6-shRNA-miR30載體，該載體是將hU6啟動子克隆到載體JMB84上得到JMB84-hU6，再將miR30克隆到JMB84-hU6中hU6的下游得到JMB84-hU6-miR30載體，然后將shRNA干擾序列克隆到JMB84-hU6-miR30中的miR30之間得到JMB84-hU6-shRNA-miR30。

所述的宿主細胞為酵母菌株JMY1[MATα,his3-Δ1?trp1-289?rad1-Δ?ura3-52]，shRNA干擾載體通過LiAc的方法轉染到宿主細胞中。