[發(fā)明專利]鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒、制備方法及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310647179.5
• 申請日: 2013-12-06
• 公開（公告）號: CN103642917A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方昕;張馳;許磊;高翔;李曉麗;李寧;方翔;崔永剛
• 申請（專利權(quán)）人: 南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京市中聞律師事務(wù)所 11388
• 代理人: 王新發(fā);常亞春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒、制備方法及檢測方法，尤其是一種特異性好，靈敏度高的鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒、制備方法及檢測方法。

背景技術(shù)

近年來，不法商販利用廉價(jià)的肉類冒充高價(jià)牛、羊肉的肉類摻假事件頻發(fā)。更為嚴(yán)重的是，近期市面上出現(xiàn)了用來源不明的鼠肉冒充羊肉的惡性案例，引起社會各界廣泛關(guān)注。鼠肉摻假不僅影響了肉類產(chǎn)品市場的正常運(yùn)行，更造成了嚴(yán)重食品安全隱患。老鼠多生活于潮濕臟亂的環(huán)境中，攜帶多種細(xì)菌病毒。死鼠肉極易腐爛而滋生細(xì)菌，一些死鼠體內(nèi)還含有老鼠藥等強(qiáng)力毒藥成分。因此，一旦老鼠肉被混摻入食用肉類及肉制品，食用后會造成人體中毒，輕則惡心、嘔吐，重則可能導(dǎo)致死亡。?

以聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)已成為食品溯源，尤其是肉類種屬鑒別的核心技術(shù)。該技術(shù)針對不同物種基因序列的差異，設(shè)計(jì)特異性的引物，利用PCR擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)現(xiàn)食品中特征基因片段的指數(shù)級擴(kuò)增，從而鑒別食品中的物種來源。實(shí)時熒光PCR的發(fā)展和應(yīng)用提高了食品溯源方法的靈敏度，并為肉類及肉制品定量定性分析提供技術(shù)支持。目前，基于線粒體基因設(shè)計(jì)特異性的引物而建立PCR法和實(shí)時熒光PCR的方法已見大量報(bào)道，市面上已有許多利用此類方法檢測肉及肉制品源性的試劑盒，在肉制品摻假控制與監(jiān)管中發(fā)揮了重要作用。

然而，此類試劑盒多用于對肉制品中牛、羊、豬及禽類等源性的檢測，而針對肉制品中鼠源性成分的檢測的試劑盒還未有所見。在國外，已有運(yùn)用普通PCR鑒別嚙齒目物種源性的研究，但經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，該研究中針對嚙齒目所設(shè)計(jì)的引物對豬、牛、羊等常見肉類均可以發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，特異性差。在國內(nèi)，目前市面上出現(xiàn)了針對海貍鼠源性成分的鑒定試劑盒。該試劑盒采用普通PCR方法，操作步驟繁瑣，在靈敏度和特異性上都有一定的局限性。同時，在分類學(xué)上海貍鼠并不屬于鼠科，而在國內(nèi)某些地區(qū)，海貍鼠被視為可食用的肉類，因此使用海貍鼠摻假肉制品的危害性遠(yuǎn)小于本發(fā)明中調(diào)研選取的鼠科樣本。

為了彌補(bǔ)鼠源性成分鑒定試劑盒的市場空缺，豐富肉制品摻假檢測方法，我們開發(fā)了肉及肉制品中鼠源性成分檢測的高靈敏度試劑盒。本發(fā)明針對生活中常見的可能摻假肉制品的鼠類，基于實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)鼠源性引物探針，具有良好的針對3種常見鼠肉的特異性，與其他肉類無交叉反應(yīng)，靈敏度高達(dá)1皮克/反應(yīng)，且總檢測時間可控制在2小時以內(nèi)，對肉制品摻假的監(jiān)管和控制有著重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

為了對肉制品摻假進(jìn)行監(jiān)管和控制，本發(fā)明提供了一種特異性好，靈敏度高的鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒、制備方法及檢測方法。

為實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明提供了一種鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成：

預(yù)混液1，其包含Taqman熒光定量PCR?反應(yīng)Taq酶1.25U,?dNTP各0.2μM，PH8.5的Tris-HCl?10?mM，KCl?50mM，MgCl₂?1.5?mM；儲藏條件為4?oC，保質(zhì)期半年。

預(yù)混液2，其包含引物A?2μM,?序列為5'-CCGCCCAATCACCCAAA-3'，引物B?2μM，?序列為5'-GCCTCCGATTCATGTTAAGA-3'，序列熒光探針C4μM，序列為5'-FAM-TACTGAATYCTAGTAGCCAAC-TAMRA-3',?熒光探針D?4μM，序列為5'-CY5-TGGTCTTCTTAGCGAGAGTG-TAMRA-3'，以及內(nèi)參核酸?0.005ng/μL；儲藏條件為-20?oC，避光，保質(zhì)期半年。

本發(fā)明還提供了一種鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

S21、提取常見鼠肉DNA并制作模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序；

S22、鼠肉測序結(jié)果與其他肉類DNA的同源基因比對，篩選出鼠類特異序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物和熒光探針；

S23、設(shè)計(jì)陽性內(nèi)參，消除反應(yīng)體系中假陰性；

S24、驗(yàn)證方法的特異性，優(yōu)化反應(yīng)條件，制作試劑盒；

S25：使用梯度稀釋的目標(biāo)物種DNA，確定反應(yīng)體系的檢測靈敏度。