[發(fā)明專利]鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒、制備方法及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310647179.5
• 申請(qǐng)日: 2013-12-06
• 公開（公告）號(hào): CN103642917A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方昕;張馳;許磊;高翔;李曉麗;李寧;方翔;崔永剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京市中聞律師事務(wù)所 11388
• 代理人: 王新發(fā);常亞春

1.一種鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒，其特征在于，由以下試劑構(gòu)成：

預(yù)混液1，其包含Taqman熒光定量PCR?反應(yīng)Taq酶1.25U,?dNTP各0.2μM，?PH8.5的Tris-HCl?10?mM，KCl?50mM，MgCl₂?1.5?mM；儲(chǔ)藏條件為4?oC，保質(zhì)期半年；?

預(yù)混液2，其包含引物A?2μM,?序列為5'-CCGCCCAATCACCCAAA-3'，引物B?2μM，?序列為5'-GCCTCCGATTCATGTTAAGA-3'，序列熒光探針C4μM，序列為5'-FAM-TACTGAATYCTAGTAGCCAAC-TAMRA-3',?熒光探針D?4μM，序列為5'-CY5-TGGTCTTCTTAGCGAGAGTG-TAMRA-3'，以及內(nèi)參核酸?0.005ng/μL；儲(chǔ)藏條件為-20?oC，避光，保質(zhì)期半年。

2.一種鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S21、提取常見鼠肉DNA并制作模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；

S22、鼠肉測(cè)序結(jié)果與其他肉類DNA的同源基因比對(duì)，篩選出鼠類特異序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物和熒光探針；

S23、設(shè)計(jì)陽(yáng)性內(nèi)參，消除反應(yīng)體系中假陰性；

S24、驗(yàn)證方法的特異性，優(yōu)化反應(yīng)條件，制作試劑盒；

S25：使用梯度稀釋的目標(biāo)物種DNA，確定反應(yīng)體系的檢測(cè)靈敏度。

3.如權(quán)利要求２所述的鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒的制備方法，其特征在于，

步驟S21具體包括：反應(yīng)體系為25μL，其中包括12.5μL?premix?Taq?(2X,?Takara,?version?2.0),?0.5μL?10μM?Seq?正、反向引物,?100ng?模板DNA?和ddH₂O；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min；30個(gè)循環(huán)的95℃?30s、50℃?30s、72℃?1min；72℃?延伸7min。

4.如權(quán)利要求２所述的鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒的制備方法，其特征在于，

步驟S22具體包括：探針的3’端用發(fā)光基團(tuán)FAM標(biāo)記，5’端用淬滅基團(tuán)BHQ標(biāo)記；在探針合成中等量分配兩種堿基C/T。

5.如權(quán)利要求２所述的鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒的制備方法，其特征在于，

步驟S23具體包括：陽(yáng)性內(nèi)參是由質(zhì)粒pUC57插入一段重組基因構(gòu)成；重組基因的序列為5’-CCGCCCAATCACCCAAATTGGTCTTCTTAGCGAGAGTGGCTGTCACGGGATTCGCTAAAATTCCCAGCGAAACCAGGCGGGAGTCTGGACACGTCGTTGGTACCATGATGAAGTGGCTGACATGATCACCGCGATGCGCCCAGGACATAATCTTAACATGAATCGGAGGC-3’。

6.如權(quán)利要求２所述的鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒的制備方法，其特征在于，

步驟S24具體包括：反應(yīng)體系為20μL，其中包括Taq酶1.25U,?dNTP各0.2μM，?PH8.5的Tris-HCl?10?mM，KCl?50mM，MgCl₂?1.5?mM,?10μM引物A、B各0.4μL,?0.8μL?10μM?探針C,?0.8μL?10μM?內(nèi)參探針D,?0.2μL?ROX?dye?II?(Takara,?version?2.0)，100ng?模板DNA和?ddH₂O；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10min；30個(gè)循環(huán)的95℃?5s、55℃?30s、60℃?20s。

7.一種鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

S31：取肉或肉產(chǎn)品中提取的DNA?1μL?與17μL?預(yù)混液1，2μL預(yù)混液2在冰上混合均勻；

S32：將混合好的試劑至于熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)；

S33：當(dāng)內(nèi)參CY5熒光信號(hào)在Ct值35左右發(fā)生擴(kuò)增，說明PCR體系反應(yīng)良好。

8.如權(quán)利要求７所述的鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒的的檢測(cè)方法，其特征在于，

步驟S32具體包括：反應(yīng)條件設(shè)為：95°C?預(yù)變性10?min,?40個(gè)循環(huán)的95°C?5s、55°C?30s，最后保存于4°C。