[發明專利]布魯菌外膜蛋白抗體檢測ELISA試劑盒

在審

• 申請號: 201310646920.6
• 申請日: 2013-12-04
• 公開（公告）號: CN104698182A
• 公開（公告）日: 2015-06-10
• 發明（設計）人: 韓雪清;王慧煜;林祥梅;賈廣樂;張小娟
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12N15/70;C12R1/01
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種布魯菌外膜蛋白抗體檢測ELISA試劑盒。

背景技術

布魯菌病是由布魯菌屬細菌引起的重大人獸共患疾病，嚴重影響著家畜的生產力和動物性產品的生物安全，給畜牧業發展造成嚴重的經濟損失。據世界統計資料表明，每年因布魯菌病造成的經濟損失近30億美元。我國每年牛、羊、豬感染有百萬頭之多，所造成的經濟損失可達十幾億元。我國就新疆、甘肅兩地概算，每年因布魯菌病造成的直接經濟損失約1億元。據農業部統計，2011年12月，僅1個月我國河北、內蒙古、遼寧、黑龍江、浙江、甘肅、新疆等地區牛和綿羊共發生布魯菌病468次，發病數約1萬頭，捕殺近8000頭。同時，野生動物布魯菌病的存在，也是對畜牧業的發展和人類健康的一種潛在威脅。

布魯菌病的診斷技術從總體上分為細菌學檢測、免疫學檢測和PCR檢測等幾類方法。細菌學檢測是診斷布魯菌感染的金標準，由于布魯菌培養條件苛刻，操作人員存在被感染風險，沒有廣泛應用。血清學檢測是發現部分疫情和了解疫情的重要手段。OIE指定布魯菌檢測試驗有緩沖布氏桿菌抗原試驗、ELISA和補體結合試驗，而我國布魯菌病診斷國標是2002年制訂的動物布魯菌病診斷技術（GB/T18646-2002），檢測方法有虎紅平板凝集試驗、乳牛全乳環狀試驗、試管凝集試驗和補體結合試驗。虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗試驗因假陽性、假陰性結果較多而易造成誤判；乳牛全乳環狀試驗結果易受動物機體內環境影響而造成誤判；補體結合試驗因操作繁瑣、費時而在實際應用中較少。

ELISA近年來以操作簡易、貯存方便、高敏感性和高特異性等優勢逐漸成為布魯菌病檢測的重要手段，而我國尚未推廣快速、敏感、高通量的ELISA檢測方法用于實際生產及口岸檢測。此外，完整的細菌作為ELISA包被抗原是最經典的，但因為布魯菌培養條件苛刻、不易培養，而且存在生物安全隱患。國內外在選用ELISA作為檢測布魯菌病的常用方法時，大多是從牛種布魯菌S1119-3或S99株中提取光滑型脂多糖（sLPS）作為抗原，這種抗原易與其它菌發生交叉反應，減低試驗的準確性。因而利用生物工程技術表達單一性抗原表位作為檢測抗原，既安全有效，又解決了脂多糖作為抗原易與其它病原菌發生交叉反應的問題。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種快速、敏感、簡便的布魯菌外膜蛋白抗體檢測ELISA試劑盒。

為了實現本發明目的，本發明提供一種布魯菌外膜蛋白抗體檢測ELISA試劑盒，其特征在于，其利用大腸桿菌表達的布魯菌外膜蛋白OMP28作為抗原包被酶標板，用布魯菌標準陽性血清和陰性血清分別作為陽性對照血清和陰性對照血清，以HRP標記的羊抗牛IgG作為酶標抗體。

本研究在篩選ELISA抗原時，選用了OMP19和OMP28兩種蛋白作為候選對象，但試驗中發現經克隆表達的OMP19蛋白不穩定，易降解，不易純化；與之相比，OMP28則相對穩定、多次試驗均易獲得高純度的可溶性蛋白。優化好條件，以OMP14、OMP15、OMP39作為包被抗原檢測臨床陰性血清和陽性血清時，OD450nm值幾乎沒有區別，特異性差；與之相比，OMP28作為包被抗原檢測臨床陰性血清和陽性血清時，P/N在3.0以上，特異性強。因此，OMP28是具有較好反應原性的穩定蛋白質，可作為ELISA試劑盒的包被抗原。

進一步地，所述大腸桿菌表達的布魯菌外膜蛋白OMP28的制備方法如下：

（1）設計引物

參照NCBI中提供的牛型布魯菌OMP28的基因序列（CP003176），用Primer5.0軟件設計引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。上游引物為：5’-CGCGGATCCATGAACACTCGTGCTAGC-3'；下游引物為：5’-CCGCTCGAGTTACTTGATTTCAAAAACG-3'。為了便于后續的克隆，在上、下游引物的5'端分別添加BamHI和XhoI酶切位點（下劃線標出）。

（2）OMP28基因的擴增

以牛型布魯菌A544株基因組DNA為模板，擴增OMP28基因，用膠回收試劑盒回收PCR產物。

（3）克隆載體和表達載體的構建

用BamHI酶和XhoI酶將回收的OMP28PCR產物定向克隆于原核表達載體pET-28a（+），轉化大腸桿菌DH5α，篩選得到陽性重組質粒。

（4）重組蛋白的制備