[發明專利]布魯菌外膜蛋白抗體檢測ELISA試劑盒

在審

• 申請號: 201310646920.6
• 申請日: 2013-12-04
• 公開（公告）號: CN104698182A
• 公開（公告）日: 2015-06-10
• 發明（設計）人: 韓雪清;王慧煜;林祥梅;賈廣樂;張小娟
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12N15/70;C12R1/01
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種布魯菌外膜蛋白抗體檢測ELISA試劑盒，其特征在于，其利用大腸桿菌表達的布魯菌外膜蛋白OMP28作為抗原包被酶標板，用布魯菌標準陽性血清和陰性血清分別作為陽性對照血清和陰性對照血清，以HRP標記的羊抗牛IgG作為酶標抗體。

2.根據權利要求1所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述大腸桿菌表達的布魯菌外膜蛋白OMP28的制備方法如下：

（1）設計引物

根據牛型布魯菌OMP28的基因序列設計引物：

上游引物為：5’-CGCGGATCCATGAACACTCGTGCTAGC-3'；

下游引物為：5’-CCGCTCGAGTTACTTGATTTCAAAAACG-3'；

在上、下游引物的5'端分別添加BamHI和XhoI酶切位點；

（2）OMP28基因的擴增

以牛型布魯菌A544株基因組DNA為模板，擴增OMP28基因；

（3）克隆載體和表達載體的構建

用BamHI酶和XhoI酶將回收的OMP28PCR產物定向克隆于原核表達載體pET-28a，轉化大腸桿菌DH5α，篩選得到陽性重組質粒；

（4）重組蛋白的制備

將重組質粒pET-28a-OMP28轉化到大腸桿菌BL21中，經IPTG誘導表達，用Ni-NTA瓊脂糖親合層析純化得到重組OMP28蛋白。

3.根據權利要求2所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述OMP28基因的擴增步驟中，PCR擴增的工作體系為25μL：DNA模板1.0μL，10μmol/L上游引物F1.0μL，10μmol/L下游引物R1.0μL，2×Master?Mix12.5μL，滅菌去離子水9.5μL；反應參數：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃1min，35個循環，72℃延伸7min，冷卻至4℃。

4.根據權利要求2所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述篩選得到陽性重組質粒的具體過程為，將轉化后的大腸桿菌DH5α細胞涂布到含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，于37℃培養過夜，次日，從LB平板上隨機挑取5個菌落，接種于含50μg/mL卡那霉素的LB培養基中，于37℃培養16h，提取質粒，進行PCR鑒定，將PCR鑒定為陽性的質粒再進行酶切鑒定，將酶切鑒定為陽性的質粒測序，得到陽性重組質粒。

5.根據權利要求1所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述酶標板的制備方法如下：

（1）抗原包被：無菌條件下，將純化的重組蛋白OMP28于pH9.6的碳酸緩沖液中按1μg/ml稀釋，100μL/孔加到96孔酶標板中，濕盒內37℃包被1h；

（2）洗滌：以pH值為7.4的PBST作洗滌液，300μL/孔，每次室溫作用2min，洗滌4次。最后一次甩掉洗滌液后，在吸濕紙上用力排干；

（3）封閉：用含5%脫脂乳的PBST按160ul/孔，加入至酶標板中，37℃封閉30min，洗滌4次。最后一次甩掉洗滌液后，在吸濕紙上用力排干，后自然晾干；

（4）包裝：將封閉好的酶標板放于鋁箔袋中，加入包裝為1g的干燥劑，用真空包裝機將酶標板包裝好，貼標簽。

6.根據權利要求1所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述陽性對照血清和陰性對照血清的制備方法如下：

（1）陽性對照血清的制備：在無菌條件下，將布魯菌標準陽性血清，用2ml蒸餾水稀釋，加入0.01%硫柳汞以防腐；

（2）陰性對照血清的制備：在無菌條件下，將布魯菌標準陰性血清，用2ml蒸餾水稀釋，加入0.01%硫柳汞以防腐。

7.根據權利要求1-6任一項所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還配以洗滌液、底物溶液A、底物溶液B和終止液。

8.根據權利要求7所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述洗滌液的制備方法如下：無菌條件下，用0.22μm濾器過濾后的Tween-20加到經高壓滅菌的20×PBS中，配成1%的20×PBST貯存液。

9.根據權利要求7所述的ELISA試劑盒，其特征在于，終止液為2mol/L硫酸。