[發(fā)明專利]一種分離植物病原真菌的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310645938.4
• 申請日: 2013-12-04
• 公開（公告）號: CN103667080A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 單志慧;楊中路;陳海峰;沙愛華;邱德珍;張嬋娟;陳李淼;周蓉;楊定鵬;魏好;陳水蓮;周新安
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物病原微生物領(lǐng)域，涉及一種分離植物病原真菌的方法。

背景技術(shù)

大豆在其生長過程中受到數(shù)十種病原菌的危害，病原分離是植物病理研究、植物抗病鑒定、植物抗病生理以及進行病害防控研究中最基本的步驟。通常對病原分離的方法是：首先將受害組織徹底消毒，而后將受害組織接種于適于真菌生長的PDA培養(yǎng)基中，經(jīng)過3-5次純化培養(yǎng)后，獲得純化的病原。常規(guī)的方法對受害組織的表面消毒要求嚴(yán)格，分離過程的全程需在無菌條件下完成。常規(guī)方法的缺陷在于：1）操作過程要求嚴(yán)格的無菌條件，這對于分離一些生長在植物表面的微生物、室外考察、野外收集病原十分不便；2）分離組織因嚴(yán)格的表面消毒常常會殺死對消毒劑敏感的病原，致使病原分離失敗或降低病原分離效率。因此，開發(fā)一種簡便的病原分離方法成為提高病原研究效率的迫切需要。

植物病理學(xué)研究表明：多數(shù)植物病原為異養(yǎng)生物，其可在馬鈴薯培養(yǎng)基或其他培養(yǎng)基上快速生長。病原對植物的侵染過程也是病原菌在植物體內(nèi)生長的過程，利用病原與植物細(xì)胞的生長條件不同，將受侵染組織置于有利于病原菌生長的培養(yǎng)基中，可將病原分離出來，經(jīng)過多次純化，便可得到適于病理學(xué)研究的病原。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種簡單、易行的分離植物病原真菌的方法。

本發(fā)明所提供的分離植物病原真菌的方法，可包括如下步驟：

（1）植物樣品前處理：將待分離植物樣品受病原真菌侵染的部位（出現(xiàn)病原真菌病斑的部位）用體積比70-75%（如75%）的酒精進行擦拭，去除表面泥土，晾干酒精；

（2）病原真菌的分離培養(yǎng)：將經(jīng)過步驟（1）前處理的植物樣品置于分離培養(yǎng)基上，25-28℃（如28℃）培養(yǎng)1-2天（直至菌落直徑約為1CM左右）；

（3）病原真菌的純化培養(yǎng)：將經(jīng)過步驟（2）培養(yǎng)得到的菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)入純化培養(yǎng)基中25-28℃（如28℃）培養(yǎng)3-4天，重復(fù)操作2～4次，每次重復(fù)均將上一次培養(yǎng)所得菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)入新的純化培養(yǎng)基中25-28℃（如28℃）培養(yǎng)3-4天，最終得到純化的病原真菌。

在上述方法中，所述分離培養(yǎng)基可為含有終濃度為100mg/L頭孢霉素的PDA固體培養(yǎng)基；所述純化培養(yǎng)基為不含有任何抗生素的PDA固體培養(yǎng)基。

所述PDA固體培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下：馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂15g/L；pH5.0-8.0。

進一步，在本發(fā)明中，所述PDA固體培養(yǎng)基是用馬鈴薯培養(yǎng)基成品粉劑（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為HB0233）用水配制并滅菌后得到的，其用量為每升培養(yǎng)基中含有40克粉劑。

在上述方法的步驟（1）中，將所述待分離植物樣品受病原真菌侵染的部位用酒精進行擦拭并晾干后，還包括將所述待分離植物樣品受病原真菌侵染部位的組織切成（0.2～0.3）cm×（0.2～0.3）cm，如0.2cm×0.2cm，再如0.2cm×0.3cm的小塊的步驟。將所得（0.2～0.3）cm×（0.2～0.3）cm的小塊進行步驟（2）的分離培養(yǎng)。

在上述方法的步驟（3）中，所述菌落邊緣的菌絲具體可為取自菌落邊緣處面積為0.3cm×（0.3～0.5）cm，如0.3cm×0.3cm，再如0.3cm×0.5cm的菌絲。

分離純化后的真菌可用于常規(guī)微生物學(xué)和植物病理學(xué)研究。

在上述方法中，所述植物可為大豆、辣椒、柑桔等常見農(nóng)作物、蔬菜與水果。

在本發(fā)明的一個實施例中，所述植物具體為大豆。

在上述方法中，所述病原真菌為非專性寄生真菌，如寄生在植物體表面的非專性寄生真菌。

進一步，在本發(fā)明中，所述病原真菌為炭疽病病原真菌、擬莖點霉種腐病病原真菌、黑斑病病原真菌。