[發(fā)明專利]一種分離植物病原真菌的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310645938.4
• 申請(qǐng)日: 2013-12-04
• 公開（公告）號(hào): CN103667080A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 單志慧;楊中路;陳海峰;沙愛華;邱德珍;張嬋娟;陳李淼;周蓉;楊定鵬;魏好;陳水蓮;周新安
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所
• 主分類號(hào): C12N1/14
• 分類號(hào): C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物病原微生物領(lǐng)域，涉及一種分離植物病原真菌的方法。

背景技術(shù)

大豆在其生長過程中受到數(shù)十種病原菌的危害，病原分離是植物病理研究、植物抗病鑒定、植物抗病生理以及進(jìn)行病害防控研究中最基本的步驟。通常對(duì)病原分離的方法是：首先將受害組織徹底消毒，而后將受害組織接種于適于真菌生長的PDA培養(yǎng)基中，經(jīng)過3-5次純化培養(yǎng)后，獲得純化的病原。常規(guī)的方法對(duì)受害組織的表面消毒要求嚴(yán)格，分離過程的全程需在無菌條件下完成。常規(guī)方法的缺陷在于：1）操作過程要求嚴(yán)格的無菌條件，這對(duì)于分離一些生長在植物表面的微生物、室外考察、野外收集病原十分不便；2）分離組織因嚴(yán)格的表面消毒常常會(huì)殺死對(duì)消毒劑敏感的病原，致使病原分離失敗或降低病原分離效率。因此，開發(fā)一種簡便的病原分離方法成為提高病原研究效率的迫切需要。

植物病理學(xué)研究表明：多數(shù)植物病原為異養(yǎng)生物，其可在馬鈴薯培養(yǎng)基或其他培養(yǎng)基上快速生長。病原對(duì)植物的侵染過程也是病原菌在植物體內(nèi)生長的過程，利用病原與植物細(xì)胞的生長條件不同，將受侵染組織置于有利于病原菌生長的培養(yǎng)基中，可將病原分離出來，經(jīng)過多次純化，便可得到適于病理學(xué)研究的病原。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種簡單、易行的分離植物病原真菌的方法。

本發(fā)明所提供的分離植物病原真菌的方法，可包括如下步驟：

（1）植物樣品前處理：將待分離植物樣品受病原真菌侵染的部位（出現(xiàn)病原真菌病斑的部位）用體積比70-75%（如75%）的酒精進(jìn)行擦拭，去除表面泥土，晾干酒精；

（2）病原真菌的分離培養(yǎng)：將經(jīng)過步驟（1）前處理的植物樣品置于分離培養(yǎng)基上，25-28℃（如28℃）培養(yǎng)1-2天（直至菌落直徑約為1CM左右）；

（3）病原真菌的純化培養(yǎng)：將經(jīng)過步驟（2）培養(yǎng)得到的菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)入純化培養(yǎng)基中25-28℃（如28℃）培養(yǎng)3-4天，重復(fù)操作2～4次，每次重復(fù)均將上一次培養(yǎng)所得菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)入新的純化培養(yǎng)基中25-28℃（如28℃）培養(yǎng)3-4天，最終得到純化的病原真菌。

在上述方法中，所述分離培養(yǎng)基可為含有終濃度為100mg/L頭孢霉素的PDA固體培養(yǎng)基；所述純化培養(yǎng)基為不含有任何抗生素的PDA固體培養(yǎng)基。

所述PDA固體培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下：馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂15g/L；pH5.0-8.0。

進(jìn)一步，在本發(fā)明中，所述PDA固體培養(yǎng)基是用馬鈴薯培養(yǎng)基成品粉劑（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為HB0233）用水配制并滅菌后得到的，其用量為每升培養(yǎng)基中含有40克粉劑。

在上述方法的步驟（1）中，將所述待分離植物樣品受病原真菌侵染的部位用酒精進(jìn)行擦拭并晾干后，還包括將所述待分離植物樣品受病原真菌侵染部位的組織切成（0.2～0.3）cm×（0.2～0.3）cm，如0.2cm×0.2cm，再如0.2cm×0.3cm的小塊的步驟。將所得（0.2～0.3）cm×（0.2～0.3）cm的小塊進(jìn)行步驟（2）的分離培養(yǎng)。

在上述方法的步驟（3）中，所述菌落邊緣的菌絲具體可為取自菌落邊緣處面積為0.3cm×（0.3～0.5）cm，如0.3cm×0.3cm，再如0.3cm×0.5cm的菌絲。

分離純化后的真菌可用于常規(guī)微生物學(xué)和植物病理學(xué)研究。

在上述方法中，所述植物可為大豆、辣椒、柑桔等常見農(nóng)作物、蔬菜與水果。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述植物具體為大豆。

在上述方法中，所述病原真菌為非專性寄生真菌，如寄生在植物體表面的非專性寄生真菌。

進(jìn)一步，在本發(fā)明中，所述病原真菌為炭疽病病原真菌、擬莖點(diǎn)霉種腐病病原真菌、黑斑病病原真菌。