[發(fā)明專利]基于長(zhǎng)探針同時(shí)檢測(cè)多種微量靶標(biāo)的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310643752.5
• 申請(qǐng)日: 2013-12-03
• 公開（公告）號(hào): CN103642939A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪平;徐英武;呂洪玉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種多重性微量檢測(cè)分析方法，具體涉及一種基于連接酶反應(yīng)的新型長(zhǎng)探針微量核酸電泳檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

病原體作為一類重要病害微生物，嚴(yán)重影響臨床診斷、水與環(huán)境分析、食品安全及生物防治等諸多方面。特別是2013年在中國(guó)中部地區(qū)爆發(fā)的H7N9高致病禽流感，再次向人類提出控制和檢測(cè)病原體已經(jīng)成為一項(xiàng)非常必要與緊迫的任務(wù)。因此，建立有效的診斷方法對(duì)于病原體的防治以及提高動(dòng)植物的品質(zhì)都具有非常重要的意義。

馬鈴薯作為世界性糧食作物之一，長(zhǎng)期受到多種馬鈴薯病毒的侵染，對(duì)馬鈴薯的產(chǎn)量與品質(zhì)均造成嚴(yán)重的影響。在病毒侵染農(nóng)作物長(zhǎng)期共生進(jìn)化過程中，寄主通過基因沉默抵御病毒的侵染，而病毒為了對(duì)抗寄主基因沉默防御機(jī)制產(chǎn)生了具有拮抗功能的沉默抑制因子，這些抑制因子具有解除或干擾宿主的基因沉默途徑的功能(Olivier?V,2001.,Lakatos?L?et?al.,2006）。研究這些抑制因子，有助于深入理解病毒與宿主間的相互作用關(guān)系，對(duì)于進(jìn)一步防御病原體的具有重要的意義。目前在馬鈴薯病毒中已發(fā)現(xiàn)馬鈴薯卷葉病毒(Potato?leafroll?virus，PLRV)P0基因、煙草脆裂病毒(Tobacco?rattle?virus，TRV)16kDa基因、黃瓜花葉病毒(Cucumber?mosaic?virus，CMV)2b基因、甜菜西方黃化病毒(Beet?western?yellows?virus，BWYV）P0基因、馬鈴薯Y病毒(Potato?virus?Y，PVY)HcPro(Helper?component-proteinase)基因、馬鈴薯X病毒(Potato?virus?X，PVX）P25基因具有抑制基因沉默的功能(Renovell?et?al.,2012;Moissiard?and?Voinnet2004;Chiu?et?al.,2010;Fukuzawa?et?al.,2010)，這六種抑制因子均是通過Argonaute(AGO)家族蛋白介導(dǎo)基因沉默。鑒于馬鈴薯能同時(shí)被多種病毒感染，極有可能多種抑制因子同時(shí)參與抑制多種病毒感染的現(xiàn)象，從而介導(dǎo)基因沉默的現(xiàn)象，同時(shí)由于參與介導(dǎo)基因沉默的抑制因子在馬鈴薯中的含量的比較低，因此，建立一種方法同時(shí)檢測(cè)多種微量病原體就顯得尤為迫切與必要。

目前涉及植物病原體的檢測(cè)方法很多如：指示植物檢測(cè)法、電鏡技術(shù)、以蛋白為基礎(chǔ)的免疫學(xué)方法、核酸介導(dǎo)的分子生物學(xué)方法。指示植物檢測(cè)法（吳凌娟等，2003；徐潔，2002）具有檢測(cè)便捷、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但需要專門防蟲溫室，培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，而且需要定期殺蟲與澆水。此外，指示植物與病毒種類的不同，采用的光照和溫度培養(yǎng)的條件也相應(yīng)的不同。這些條件制約著指示植物鑒定法的應(yīng)用。吳興泉等（2004）利用電鏡技術(shù)成功鑒定帶有花葉癥狀的馬鈴薯感染PVX病毒。但電鏡技術(shù)受到以下限制：的操作環(huán)境必須是真空，對(duì)觀察者的操作技術(shù)以及知識(shí)儲(chǔ)備要求比較高，同時(shí)需要對(duì)所檢測(cè)的生物樣品進(jìn)行取材、漂洗、固定、脫水、浸透、包埋、聚合、切片以及染色等步驟的處理，消耗時(shí)間長(zhǎng)（Naja?et?al.,2008;Nishiyama?et?al.,2010）。因此，利用電鏡技術(shù)檢測(cè)馬鈴薯病毒受到很大的限制。Singh?et?al（1992）利用免疫學(xué)方法成功區(qū)分PVY^N，PVY^O，PVY^N:O三種株系，但是Weidemann?et?al（1998）利用免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)PVY^N和PVY^NTN時(shí)，出現(xiàn)血清交叉反應(yīng)，并且檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定。此外，免疫學(xué)檢測(cè)方法不能用于純度與含量低病毒以及缺少外殼蛋白的類病毒檢測(cè)。同時(shí)該方法容易被污染易產(chǎn)生假陽性（Matic?S?et?al.,2009）。