[發明專利]基于長探針同時檢測多種微量靶標的方法

有效

• 申請號: 201310643752.5
• 申請日: 2013-12-03
• 公開（公告）號: CN103642939A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 汪平;徐英武;呂洪玉
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.基于長探針同時檢測多種靶標的方法，其特征在于包括以下特征：

1）、獲取待檢測的靶標及其內參18S?rRNA的核酸序列，利用相關軟件比對每種靶標的各個株系的核酸序列，獲得每種靶標的保守區；再在每種待檢測靶標及其內參18S?rRNA的保守區設計緊密相連的兩條寡核苷酸的鑒別探針，即上游鑒別探針和下游鑒別探針，所述上、下游鑒別探針是一對首尾相連并與各自的靶標序列互補的寡聚核苷酸，每種待檢測的靶標及其內參18S?rRNA分別設計兩組上、下游鑒別探針；

2）、設計通用引物及選擇填充物長序列，所述通用引物由上、下游通用引物組成，所述填充物、通用引物以及待檢測的靶標序列均無同源性且不形成穩定空間結構的寡聚核苷酸；通用序列Tag2的3′與上游鑒別探針的5′相連組成上游LDR探針，填充物長序列與通用序列Tag1的5′端及下游鑒別探針的3′端相連組成下游LDR長探針；通用序列Tag1與下游通用引物互補，通用序列Tag2與上游通用引物相同；

3）、將上游LDR探針和下游LDR長探針與待檢測的靶標樣品一起進行連接酶檢測反應，得到連接產物；

4）、利用上、下游通用引物擴增連接產物，通過瓊脂糖核酸電泳獲得條帶信息，從而獲知混合靶標的感染情況；

當出現與上述待檢測靶標長度相同的條帶時，被認定為感染了該待檢測靶標；

反之，當沒有出現任何條帶時，被認定為沒有感染待檢測靶標。

2.根據權利要求1所述的基于長探針同時檢測多種靶標的方法，其特征在于：

所述待檢測的靶標為16kDa?^TRV、2b^CMV、P0^BWYV、HcPro^PVY、P25^PVX、P0^PLRV；

所述步驟4）為：

16kDa?^TRV連接產物擴增長度為204bp；2b^CMV連接產物擴增長度為312bp；P0^BWYV連接產物擴增長度為398bp；18S?rRNA連接產物擴增長度為474bp；HcPro^PVY連接產物擴增長度為578bp；P25^PVX連接產物擴增長度為647bp；P0^PLRV連接產物擴增長度為793bp。

3.根據權利要求2所述的基于長探針同時檢測多種靶標的方法，其特征在于：

所述上游通用引物為：5′>GGCATCGCATAACATAAGCA<3′，下游通用引物為：

5′>GTCCGTCCAACCGTCTG<3′；通用序列Tag1與下游通用引物互補，通用序列Tag2與上游通用引物相同。