[發明專利]一種草菇菌株0229分子特異性檢測標記及其檢測方法

有效

• 申請號: 201310643580.1
• 申請日: 2013-12-03
• 公開（公告）號: CN103834641B
• 公開（公告）日: 2017-10-31
• 發明（設計）人: 汪虹;王瑩;陳明杰;鮑大鵬;馮愛萍
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所31233
• 代理人: 黃志達

技術領域

本發明屬于草菇菌種檢測標記及其檢測領域，特別涉及一種草菇菌株0229分子特異性檢測標記及其檢測方法。

背景技術

草菇（Volvariella volvacea）栽培起源于中國，迄今已有300多年的栽培歷史，在我國南方地區廣泛栽培。草菇味道鮮美，不僅具有豐富的營養價值，而且還具有重要的醫療保健作用，深受廣大消費者喜愛。草菇作為一種高溫栽培食用菌，同其它食用菌相比，其顯著的特點是生長速度極快，從播種到收獲一般只需要2周的時間，其年產量在我國食用菌產業中一直位居前十位。

我國草菇栽培面積廣，產量曾經在食用菌中排到第五位，但品種單一，檢測主要栽培草菇菌株交配型基因的類型，發現現有的菌株多源于上世紀七十年代野生草菇分離菌株V23菌株，通過對其進行系統選育獲得，遺傳背景比較狹窄，但農藝性狀有很大差別。面對這種情況，迫切需要加快草菇菌株鑒定技術的研究，開發更為有效的菌株鑒定方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種草菇菌株0229分子特異性檢測標記及其檢測方法，該發明檢測方法與常規形態學檢測、拮抗試驗和出菇試驗等方法相比，具有檢測時間短，準確性高的優點。可以利用所獲得的分子標記鑒別草菇菌株0229，有利于草菇育種工作的開展，從而加快草菇新品種的研發工作。

本發明的一種草菇菌株0229分子特異性檢測標記，其特征在于：所述特異性檢測標記為特異性引物，其中引物序列為：

F：CTTTCAGGAAGAGCCCAGC；

R：TGAAGGGCTTGAAGGAGAAA。

本發明的一種草菇菌株0229分子特異性檢測方法，包括：

（1）將草菇菌株接種PDA平板培養基，32℃培養5d，刮取表面菌絲裝入無菌離心管中，-70℃保存，然后用改進的CTAB法提取基因組DNA，得到DNA；

（2）將上述DNA為模板，特異性檢測標記引物為擴增引物，進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，進行電泳檢測，其中特異性檢測標記引物為F：CTTTCAGGAAGAGCCCAGC；R：TGAAGGGCTTGAAGGAGAAA。

所述步驟（1）中改進的CTAB法提取基因組DNA的具體方法步驟為：將冷凍干燥的菌絲研磨成粉末，加入65℃預熱2×CTAB抽提液，分裝到2mL離心管中，65℃保溫45min，間或輕搖混勻；4℃，12000rpm離心20min，取上清液加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)混合液，輕輕混勻，15min后4℃,12000rpm離心20min。取上清液移入新離心管中，加入2/3體積-20℃預冷的異丙醇，輕輕搖動，5min后4℃,8000rpm離心10min。棄上清液，沉淀用75%乙醇（含10mmol/L NaAc）洗滌3次，每次4℃,8000rpm離心10min。最后用預冷的95%乙醇洗滌一次，輕輕上下顛倒，4℃，12000rpm離心20min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干，加入200μL雙蒸水溶解DNA沉淀。DNA溶液加入1μL10mg/mL RNase，37℃水浴1h,去除RNA。最終的DNA提取物于-20℃冰箱貯藏備用。

所述步驟（2）中PCR擴增體系為：總體積為25μL，其中10×PCR buffer II(Mg²⁺Plus)2.5μL，dNTP各2.5mM、2uL，5U/μL ExTaq DNA酶（TaKaRa公司）0.25μL，10μmol/L特異性引物對各0.5μL，50ng/μL模板DNA0.5μL，ddH₂O 18.75μL。

所述步驟（2）中PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環；72℃補平10min。

所述步驟（2）中電泳檢測方法為：取PCR擴增產物20μL，與12μL加樣緩沖液混勻，于95℃變性5分鐘，結束后置于冰水混合物中冷卻3分鐘，點樣3μL與6%變性聚丙烯酰胺上電泳，電泳緩沖液為1×TBE，電壓1000V，電流200mA，功率200W，電泳45分鐘，銀染，顯色，然后在凝膠成像儀上拍照。

所述草菇菌株0229能在分子量200bp-300bp之間擴增出2條特異條帶。

原理：