[發(fā)明專利]一種草菇菌株0229分子特異性檢測(cè)標(biāo)記及其檢測(cè)方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201310643580.1 | 申請(qǐng)日： | 2013-12-03 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN103834641B | 公開（公告）日： | 2017-10-31 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 汪虹;王瑩;陳明杰;鮑大鵬;馮愛萍 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 |
| 主分類號(hào)： | C12N15/11 | 分類號(hào)： | C12N15/11;C12Q1/68 |
| 代理公司： | 上海泰能知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所31233 | 代理人： | 黃志達(dá) |
| 地址： | 201106 *** | 國(guó)省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 草菇 菌株 0229 分子 特異性 檢測(cè) 標(biāo)記 及其 方法 | ||
1.一種草菇菌株0229分子特異性檢測(cè)標(biāo)記，其特征在于：所述特異性檢測(cè)標(biāo)記為特異性引物，其中引物序列為：
F：CTTTCAGGAAGAGCCCAGC；
R：TGAAGGGCTTGAAGGAGAAA。
2.一種草菇菌株0229分子特異性檢測(cè)方法，包括：
(1)將草菇菌株接種PDA平板培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)5d，將表面菌絲裝入無菌管中，-70℃保存，然后用改進(jìn)的CTAB法提取基因組DNA，得到DNA；
(2)將上述DNA為模板，特異性檢測(cè)標(biāo)記引物為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行電泳檢測(cè)，其中特異性檢測(cè)標(biāo)記引物為F：CTTTCAGGAAGAGCCCAGC；R：TGAAGGGCTTGAAGGAGAAA；草菇菌株0229能在分子量200bp-300bp之間擴(kuò)增出2條特異條帶，其它草菇菌株不能在相同位置同時(shí)擴(kuò)增出這2條條帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種草菇菌株0229分子特異性檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增體系為：總體積為25μL，其中10×PCR buffer II(Mg2+Plus)2.5μL，2.5mM dNTP各2uL，5U/μL ExTaq DNA酶0.25μL，10μmol/L特異性引物對(duì)各0.5μL，50ng/μL模板DNA 0.5μL，ddH2O 18.75μL。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種草菇菌株0229分子特異性檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟(2)中PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃補(bǔ)平10min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種草菇菌株0229分子特異性檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟(2)中電泳檢測(cè)方法為：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物20μL，與12μL加樣緩沖液混勻，于95℃變性5分鐘，結(jié)束后置于冰水混合物中冷卻3分鐘，點(diǎn)樣3μL與6％變性聚丙烯酰胺上電泳，電泳緩沖液為1×TBE，電壓1000V，電流200mA，功率200W，電泳45分鐘，銀染，顯色，然后在凝膠成像儀上拍照。
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