[發明專利]一種菜豆普通花葉病毒的逆轉錄環介導等溫檢測方法

有效

• 申請號: 201310643147.8
• 申請日: 2013-12-03
• 公開（公告）號: CN103667528A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 竺曉平;李剛;趙黎明
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;陳曉慶

技術領域

本發明涉及一種菜豆普通花葉病毒的逆轉錄環介導等溫檢測方法。

背景技術

菜豆普通花葉病毒（Bean?common?mosaic?virus，BCMV）是馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus的成員之一，在全世界廣泛分布，是菜豆上最主要的病毒病害之一。BCMV是一種典型的種傳病毒，幾乎可以侵染所有的食用豆作物，在菜豆上種傳率高達93%。BCMV侵染菜豆后引起葉片變窄、卷曲、皺縮、花葉、豆莢斑駁或畸形等，造成嚴重的產量損失。

環介導等溫核酸擴增技術(loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)最早是由Notomi?T等在2000年發明的，是一種基于高靈敏鏈置換技術的等溫核酸擴增方法，其工作原理為：針對靶基因的6個區域設計了4個特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶-Bst(Bacillus?stearothermophilus)DNA?polymerase在恒溫（65℃）的條件下反應1小時即可完成核酸擴增反應，反應產物既可通過電泳紫外觀察，亦可通過熒光染色直接目測。該方法操作簡便，無需特殊儀器(PCR儀)，而檢測結果準確，是一種快捷而有效的檢測方法。目前已廣泛應用于人類和動植物各種病毒、細菌、寄生蟲等引起的疾病檢測和快速診斷。該方法應用范圍廣泛，適于基層實驗室進行快速檢測。

目前在菜豆普通花葉病毒的檢測上，較常用的方法有兩種：一種是分子生物學檢測方法，其中以PCR最為常見，但是PCR需要30-35個循環反應，較費時并且需要特殊的儀器（PCR儀）、操作程序繁瑣復雜、時間長，對檢測人員較高的技術要求，大大限制了作為快速診斷方法的使用和推廣；另一種是血清學檢測方法，常見的有ELISA，血清學檢測方法除了在靈敏度上存在不足外，其檢測的特異性也受到限制。而LAMP方法很好的克服了當前這兩類方法的不足，LAMP檢測方法具有反應時間短，無需特殊儀器（恒溫金屬浴即可），成本低，檢測靈敏度高，特異性好，目前尚未見利用LAMP技術檢測菜豆普通花葉病毒的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種菜豆普通花葉病毒的逆轉錄環介導等溫檢測方法。

本發明提供的一組引物，由如下（1）-（4）所示的DNA分子組成：

（1）SEQ?ID?No.1所示的DNA分子；

（2）SEQ?ID?No.2所示的DNA分子；

（3）SEQ?ID?No.3所示的DNA分子；

（4）SEQ?ID?No.4所示的DNA分子。

一種檢測菜豆普通花葉病毒的試劑盒也屬于本發明的保護范圍，該試劑盒包含所述的引物、反轉錄酶和Bst?DNA聚合酶；

所述反轉錄酶為M-MLV反轉錄酶或AMV反轉錄酶。

一種檢測菜豆普通花葉病毒的方法也屬于本發明的保護范圍，該方法是以待測樣品的總RNA為模板，以所述引物為引物進行逆轉錄環介導等溫核酸擴增，若得到逆轉錄環介導等溫核酸擴增產物，則所述待測樣品中候選含有菜豆普通花葉病毒，若得不到逆轉錄環介導等溫核酸擴增產物，則所述待測樣品中候選不含有菜豆普通花葉病毒。

上述方法中，所述PCR擴增產物是否得到的判斷方法為如下（1）和/或（2）：

（1）將逆轉錄環介導等溫核酸擴增反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，具有彌散狀核酸電泳條帶的待測樣品為含有菜豆普通花葉病毒的樣品，不具有彌散狀核酸電泳條帶的待測樣品為不含有菜豆普通花葉病毒的樣品；

(2)將逆轉錄環介導等溫核酸擴增反應產物與SYBR?Green?I反應得反應液，反應液呈翠綠色的待測樣品候選為含有菜豆普通花葉病毒的樣品，反應液呈橙色的待測樣品候選為不含有菜豆普通花葉病毒的樣品。

上述任一所述的方法中，所述引物中SEQ?ID?No.1所示的DNA分子和SEQ?ID?No.2所示的DNA分子為外引物，SEQ?ID?No.3所示的DNA分子和SEQ?ID?No.4所示的DNA分子為內引物；

所述外引物中SEQ?ID?No.1所示的DNA分子與SEQ?ID?No.2所示的DNA分子在所述逆轉錄環介導等溫核酸擴增中的摩爾濃度比為1:1；

所述內引物中SEQ?ID?No.3所示的DNA分子與SEQ?ID?No.4所示的DNA分子在所述逆轉錄環介導等溫核酸擴增中的摩爾濃度比為1:1。

所述外引物與所述內引物在所述逆轉錄環介導等溫核酸擴增中的摩爾濃度比具體為1:5。

上述任一所述的方法中，所述逆轉錄環介導等溫核酸擴增中的反應溫度為62℃。