[發(fā)明專利]一種菜豆普通花葉病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310643147.8
• 申請(qǐng)日: 2013-12-03
• 公開（公告）號(hào): CN103667528A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 竺曉平;李剛;趙黎明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;陳曉慶

1.一組引物，由如下（1）-（4）所示的DNA分子組成：

（1）SEQ?ID?No.1所示的DNA分子；

（2）SEQ?ID?No.2所示的DNA分子；

（3）SEQ?ID?No.3所示的DNA分子；

（4）SEQ?ID?No.4所示的DNA分子。

2.一種檢測(cè)菜豆普通花葉病毒的試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引物、反轉(zhuǎn)錄酶和Bst?DNA聚合酶；

所述反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶或AMV反轉(zhuǎn)錄酶。

3.一種檢測(cè)菜豆普通花葉病毒的方法，該方法是以待測(cè)樣品的總RNA為模板，以權(quán)利要求1所述的引物為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增，若得到逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，則所述待測(cè)樣品中候選含有菜豆普通花葉病毒，若得不到逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，則所述待測(cè)樣品中候選不含有菜豆普通花葉病毒。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增產(chǎn)物是否得到的判斷方法為如下（1）和/或（2）：

（1）將逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，具有彌散狀核酸電泳條帶的待測(cè)樣品為含有菜豆普通花葉病毒的樣品，不具有彌散狀核酸電泳條帶的待測(cè)樣品為不含有菜豆普通花葉病毒的樣品；

(2)將逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物與SYBR?Green?I反應(yīng)得反應(yīng)液，反應(yīng)液呈翠綠色的待測(cè)樣品候選為含有菜豆普通花葉病毒的樣品，反應(yīng)液呈橙色的待測(cè)樣品候選為不含有菜豆普通花葉病毒的樣品。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述權(quán)利要求1所述的引物中SEQ?ID?No.1所示的DNA分子和SEQ?ID?No.2所示的DNA分子為外引物，SEQ?ID?No.3所示的DNA分子和SEQ?ID?No.4所示的DNA分子為內(nèi)引物；

所述外引物中SEQ?ID?No.1所示的DNA分子與SEQ?ID?No.2所示的DNA分子在所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增中的摩爾濃度比為1:1；

所述內(nèi)引物中SEQ?ID?No.3所示的DNA分子與SEQ?ID?No.4所示的DNA分子在所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增中的摩爾濃度比為1:1。

所述外引物與所述內(nèi)引物在所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增中的摩爾濃度比具體為1:5。

6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一所述的方法，其特征在于：所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增中的反應(yīng)溫度為62℃。

7.根據(jù)權(quán)利要求3-6任一所述的方法，其特征在于：所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增中的鎂離子濃度為5mM。

8.根據(jù)權(quán)利要求3-7任一所述的方法，其特征在于：所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增的體系如下：

10×Thermopol?buffer2.5μL，SEQ?ID?No.1所示的DNA分子0.2μM，SEQ?ID?No.2所示的DNA分子0.2μM，SEQ?ID?No.3所示的DNA分子1.0μM，SEQ?ID?No.4所示的DNA分子1.0μM，dNTPs1.0mM，MgCl25mM，反轉(zhuǎn)錄酶200U，Bst?DNA聚合酶12U，所述待測(cè)樣品的總RNA40ng，余量為ddH2O，體系25μL；

所述10×Thermopol?buffer購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為M0275；

所述反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶或AMV反轉(zhuǎn)錄酶；

所述Bst?DNA聚合酶的商品名稱為Bst?DNApolymerase，購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為M0275；

所述逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：62℃等溫1h；80℃5min。

9.根據(jù)權(quán)利要求3-8任一所述的方法，其特征在于：所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自TaKaRa公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為2641A；

所述樣品具體為待測(cè)樣品的葉片。

10.權(quán)利要求1所述的引物在檢測(cè)菜豆普通花葉病毒中的應(yīng)用；

和/或，

權(quán)利要求2所述的試劑盒在檢測(cè)菜豆普通花葉病毒中的應(yīng)用。