[發明專利]一種克隆梅花中LFY同源基因編碼區全序列的方法

有效

• 申請號: 201310642751.9
• 申請日: 2013-12-05
• 公開（公告）號: CN103667313A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 鄭炳松;江波;任韡;方仲相;方佳;何勇清
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種克隆梅花中LFY同源基因編碼區全序列的方法。

背景技術

一些研究表明LFY基因是決定花分生組織形成的必需基因(Weigel?and?N，1995)，在植物成花過程中發揮核心作用。在所有的陸生植物中都能找到LFY基因，其已有近4000萬年的進化歷史。1990年Coen等利用轉座子標簽法從金魚草中分離得到LFY的同源基因FLO，并發現其在花分生組織形成時起著重要的作用。1992年，Weigel等通過研究lfy1突變體，利用RFLP技術從擬南芥中成功克隆了LFY基因的全長，通過其表達方式及轉基因的研究認為LFY基因不僅控制著花序分生組織向花分生組織的轉變，且控制著開花時間。此后，科學家們相繼從花椰菜、煙草、楊樹等多種植物中分離克隆到了LFY的同源基因，其中LFY同源基因的全序列被克隆的有：擬南芥(7308bp)、楊樹(5656bp)、葡萄(2333bp)、桉樹(1500bp)、花椰菜(2701bp)、豌豆(2224bp)、輻射松(3306bp)、銀杏(3450bp)和臺灣苣苔(2469bp)等植物。

根據已知LFY同源基因的序列比較發現，不同植物種間氨基酸序列的長度相差不大，最長的是紅粉雪輪花的編碼序列，長為1449bp，編碼483個氨基酸，最短的是狹葉仙鶴蘚的編碼區，長為1014bp，編碼338個氨基酸。用DNAMAN等軟件比較分析已知的LFY同源基因，發現不同種間氨基酸序列的同源性都較較高，不同種間核苷酸同源性最高為98％，最低為47％，同科不同屬之間LFY基因同源性遠遠高于不同科之間的同源性。親緣關系較遠的物種間LFY基因所編碼的氨基酸具有較高的同源性說明在植物進化過程中LFY基因具有較高的保守性。

梅花為中國十大名花之首，之前研究多集中在形態觀察、生理學等相關研究，分子生物學研究也較多集中在分子標記領域，鑒于此，克隆梅花中的LFY同源基因，填補梅LFY同源基因克隆空白具有重要意義。

RT-PCR克?。菏菍NA的反轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)以及分子克隆相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的基因片段，將合成的目的基因片段克隆到載體細胞基因中，然后用菌液PCR產物測序。此技術利用PCR技術能在體外進行有效的基因擴增，可利用這一技術很快獲得其他依靠限制性內切酶消化的方法難于得到的PCR產物；克隆載體PCR測序能克服PCR產物測序引物近端的十幾個堿基無法測序獲得的缺點。與RACE(cNDA末端快速擴增)技術相比較而言，目的基因片段的長度明確，成本低，工作量小。該技術成功的關鍵是PCR引物的設計，在起始密碼子的上游設計上游引物，在終止密碼子的下游設計下游引物，使得PCR產物包含完整的基因編碼區全序列。

現有技術中采用RACE(cNDA末端快速擴增)技術：是基于PCR技術基礎上由已知的一段cDNA片段，通過往兩端延伸擴增從而獲得完整的3’端和5’端的方法。存在以缺陷：1)目的PCR產物的基因片段長度不明確；2)試驗成本高；3)工作量大，實驗技術要求高。

發明內容

為了解決現有技術中存在的技術問題，本發明提供了一種節約成本、簡便易行的克隆梅花中LFY同源基因編碼區全序列的方法。其技術方案如下：

一種克隆梅花中LFY同源基因編碼區全序列的方法，包括以下步驟：

A、基因組水平克隆

A1、提取梅花葉片中的DNA；

A2、引物的設計及PCR反應：設計一對簡并引物，上游引物在起始密碼子的上游區域設計，下游引物在終止密碼子的下游區域設計；設計的引物為：

上游引物P1：5′-GGAAAATATGGATCCRGA-3′

下游引物P2：5′-TCARTAGGGYAGGTGMTC-3′

用DNA為模板進行PCR操作擴增LFY同源基因，PCR反應體系為20ul體系：2μL10×EX?Taq?buffer，1.6μL10mmol·L^-1dNTP，0.2μL的Ex?Tap酶，上下游引物各0.4μL，1μL的DNA，14.4μL的ddH₂O.，反應條件為95℃預變性5min，30個循環：94℃，50s；58℃，50s；72℃，1min30s，最后72℃，10min；

A3、PCR產物的回收和純化；

A4、克??；

B、基因編碼區全序列克隆