[發(fā)明專利]一種克隆梅花中LFY同源基因編碼區(qū)全序列的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310642751.9
• 申請日: 2013-12-05
• 公開（公告）號: CN103667313A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭炳松;江波;任韡;方仲相;方佳;何勇清
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10
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1.一種克隆梅花中LFY同源基因編碼區(qū)全序列的方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、基因組水平克隆

A1、提取梅花葉片中的DNA；

A2、引物的設(shè)計及PCR反應(yīng)：設(shè)計一對簡并引物，上游引物在起始密碼子的上游區(qū)域設(shè)計，下游引物在終止密碼子的下游區(qū)域設(shè)計；設(shè)計的引物為：

上游引物P1：5′-GGAAAATATGGATCCRGA-3′

下游引物P2：5′-TCARTAGGGYAGGTGMTC-3′

用DNA為模板進(jìn)行PCR操作擴增LFY同源基因，PCR反應(yīng)體系為20ul體系：2μL10×EX?Taq?buffer，1.6μL?dNTP(10mmol·L^-1)，0.2μL的Ex?Tap酶，上下游引物各0.4μL，1μL的DNA，14.4μL的ddH₂O，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，30個循環(huán)：94℃，50s；58℃，50s；72℃，1min30s，最后72℃，10min；

A3、PCR產(chǎn)物的回收和純化；

A4、克隆；

B、基因編碼區(qū)全序列克隆

B1、提取梅花葉片中的總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

B2、引物的設(shè)計及PCR反應(yīng)：在基因組測序結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計一對特異性引物，上下游引物分別包括起始密碼子和終止密碼子；設(shè)計的引物為：

上游引物Q1：5′-ATGGATCCAGACGCCTTCTC-3′

下游引物Q2：5′-TCAGTAGGGTAGGTGATCACTGC-3′

用cDNA為模板進(jìn)行PCR操作擴增LFY同源基因，PCR反應(yīng)體系為20ul體系：2μL10×EX?Taq?buffer，1.6μL?dNTP：10mmol·L^-1，0.2μL的Ex?Tap酶，上下游引物各0.4μL，1μL的DNA，14.4μL的ddH₂O.)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，30個循環(huán)：94℃，50s；58℃，50s；72℃，1min30s，最后72℃10min；

B3、PCR產(chǎn)物的回收和純化；

B4、克隆。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆梅花中LFY同源基因編碼區(qū)全序列的方法，其特征在于，步驟A1中DNA的提取步驟為：

1)快速稱取0.2g果梅幼葉于預(yù)冷滅過菌的研缽中，并加入少量PVP和2％β-巰基乙醇，加液氮研磨成粉狀后立即加入600ul?STE核分離緩沖液，迅速研磨成糊狀勻漿，小心轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，上下顛倒混勻，放置0℃冰浴10min；

2)取出，4℃下5000rpm離心10min，棄上清液，若上清液仍粘稠，用STE核分離液反復(fù)清洗后離心；

3)往沉淀中加入600ul65℃預(yù)熱的3×CTAB核裂解液和10ulβ-巰基乙醇，同時洗凈管蓋及管壁上殘留的植物組織，將材料輕輕混勻，65℃水浴保溫60min，期間不時輕輕搖動離心管幾次；

4)取出，冷卻幾分鐘后加入600ul氯仿／異戊醇體積比24：1和“PCN”溶液0.0675g?PVP，45ul10％CTAB+4％NaCl，搖勻，室溫靜置5min后10000rpm離心10min；

5)轉(zhuǎn)上清液于一新的離心管，重復(fù)抽提2～3次，每次抽提時都加入“PCN”溶液去多糖；

6)取上清液，加入RNaseA至終濃度為10μg·mL^-1，37℃水浴保溫30min，取出后加入1／5體積5mol·L^-1NaCl和2倍體積預(yù)冷的乙醇，顛倒搖勻，-20℃靜置30min沉淀DNA；

7)挑出DNA集結(jié)成白色絮狀用70％的乙醇清洗2次，室溫風(fēng)干后溶于50ulTE中，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆梅花中LFY同源基因編碼區(qū)全序列的方法，其特征在于，步驟B1中所述RNA提取步驟為：

1)在10ml離心管中加入5ml?CTAB和0.2ml的β-巰基乙醇，放入65℃水浴鍋中預(yù)熱；

2)在液氮預(yù)冷好的研缽中將樣品磨細(xì)，磨樣時加入適量的PVP，分裝于預(yù)熱好的離心管中，每管3藥匙，渦旋儀上渦旋混勻1min，然后將離心管放入65℃水浴鍋中加熱，期間每個隔10min不時上下顛倒混勻，水浴持續(xù)30min；

3)再在混合物中加入3ml的酸性飽和酚：氯仿：異戊醇25：24：1，混合均勻后12000rpm，離心10min，常溫；

4)吸取離心后的上清液3.5ml轉(zhuǎn)入新的10ml離心管中，然后再加入3.5ml的氯仿：異戊醇24：1，上下顛倒混勻后12000rpm，4℃，離心10min；

5)重復(fù)第4)步，直至中間層消失；

6)第5)步完成后將上清分裝入1.5ml離心管中，每管約0.7ml，然后加入等體積的預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒混勻后放入-20℃冰箱中冷凍30min；

7)將冷凍的離心管按4℃，14000rpm，離心10min要求進(jìn)行離心，離心完成后將上面液體倒掉，保留離心管底部白色透明狀的沉淀；

8)再加入適量的65℃預(yù)熱好的SSTE溶解沉淀；

9)在溶解好沉淀的溶液里加入1ml的Trizol試劑，再加入0.25ml的氯仿，混勻后放置5-10min，12000rpm，4℃，離心10min；

10)轉(zhuǎn)移上清液于新的離心管中，加入等體積遇冷的異丙醇，混勻后放置于冰上靜置15min；

11)完成后4℃，12000rpm，離心15min收集沉淀；

12)收集到的沉淀中加入DEPC水處理的75％乙醇1ml，4℃，12000rpm，離心10min，倒去上清液，重復(fù)一次；

13)將液體倒掉，通風(fēng)條件下晾干管中液體，加入30μlDEPC水溶解沉淀。