[發(fā)明專利]用于PEI介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的聚酯殼層的熔融超聲組裝制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310642103.3
• 申請(qǐng)日: 2013-12-03
• 公開（公告）號(hào): CN103642840A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳允昆;張蕾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/87
• 分類號(hào): C12N15/87
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于基因轉(zhuǎn)染的高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種用于PEI等陽離子聚合物介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)染的聚酯保護(hù)殼層的熔融超聲自組裝制備技術(shù)。

背景技術(shù)

當(dāng)前，我國(guó)腫瘤發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，因而亟待建立針對(duì)惡性腫瘤的治療體系。在國(guó)際上，基因治療已被發(fā)展用于對(duì)抗基因缺失或突變的策略，成為腫瘤安全治療策略中的研究熱點(diǎn)。各種高效和低毒的基因運(yùn)載體隨之被積極地研究、開發(fā)，和應(yīng)用。包括多種陽離子聚合物在內(nèi)的生物高分子材料由于具有介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力，已成為取代具有潛在風(fēng)險(xiǎn)的病毒載體的新一代生物安全轉(zhuǎn)基因材料。在眾多非病毒陽離子轉(zhuǎn)基因載體中，如磷酸鈣、陽離子脂類/脂質(zhì)體、殼聚糖、聚乙烯亞胺PEI，以及基于特殊技術(shù)的材料中，高分子量（HMW）PEI因具有出色的基因傳遞能力廣泛的為人所知，而其細(xì)胞毒性亦不可忽視。PEI25k等陽離子聚合物可以通過兩種不同機(jī)制對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，即早期(30分鐘)整合至細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞壞死病變、24小時(shí)候激活線粒體介導(dǎo)的凋亡程序。能夠不影響PEI25k等陽離子聚合物負(fù)載DNA能力和實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染的二級(jí)保護(hù)載體，由于其直接在陽離子聚合物/DNA復(fù)合物表面固化成層，起到隔離PEI25k/DNA等復(fù)合物與細(xì)胞膜及細(xì)胞因子的作用，因此是一種簡(jiǎn)單易行降低轉(zhuǎn)染毒副作用、增強(qiáng)外源蛋白可控制高效表達(dá)的新思路，然而，這方面的報(bào)道并不多見，通常通過復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)共價(jià)修飾等方法達(dá)到降低HMW?PEI等陽離子聚合物毒性的目的，相對(duì)耗時(shí)，并且可能因?yàn)闇p少PEI25k等聚合物的功能基團(tuán)而削弱其結(jié)合DNA的能力。因而，實(shí)際應(yīng)用于PEI等陽離子聚合物高效轉(zhuǎn)染的保護(hù)型載體亟待開發(fā)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，超支化聚酯聚甘油醇-聚乳酸在37℃下呈現(xiàn)固體，特定條件下具有兩親性。在此基礎(chǔ)上，我們開發(fā)了用于陽離子復(fù)合物高效轉(zhuǎn)染的保護(hù)二級(jí)載體(殼層)的熔融超聲自組裝技術(shù)，該殼層形式的保護(hù)載體可保護(hù)細(xì)胞和控制胞內(nèi)外源DNA釋放，從而降低細(xì)胞毒性，達(dá)到控制外源蛋白高效表達(dá)的目的。

發(fā)明內(nèi)容

本專利針對(duì)HMW?PEI等陽離子聚合物的細(xì)胞毒性機(jī)制，設(shè)計(jì)了由具有微弱負(fù)電荷的超支化固體脂生物材料聚甘油醇-聚酯(PG-PLA)組裝形成的保護(hù)殼層，其形成過程是，在熔融超聲充分分散于揮發(fā)性有機(jī)溶劑/水的條件下發(fā)揮聚甘油醇-聚酯兩親性，在不破壞DNA活性和有效變性細(xì)菌等生物污染源蛋白組分的條件下促使PG-PLA在PEI25k/質(zhì)粒納米復(fù)合物表面共組裝形成保護(hù)層，在蒸餾、揮發(fā)有機(jī)相及降溫過程中使該保護(hù)層凝固溫相對(duì)穩(wěn)定的殼層，從而有效隔離HMWPEI與細(xì)胞膜及細(xì)胞因子的接觸、延遲HMW?PEI從細(xì)胞清除、控制質(zhì)粒DNA在細(xì)胞內(nèi)的釋放及蛋白表達(dá)時(shí)相。該納米體系將對(duì)于解決HMW?PEI等陽離子聚合物的毒性及轉(zhuǎn)染瞬時(shí)性有積極的推動(dòng)作用，在其它轉(zhuǎn)基因體系及藥物傳遞體系中也有很好的應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

下面將實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例將有助于說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。

1PG-PLA合成與鑒定

多聚甘油醇PG(48mg)和_D,L-丙交酯(222mg)混于徹底干燥、經(jīng)硅烷化處理并有攪拌子的反應(yīng)管中。加入溶解于20μL干燥甲苯的Sn(Oct)₂(0.01mg)。反應(yīng)管抽真空充氮?dú)夥磸?fù)三次，真空條件下封管，于140℃油浴鍋中反應(yīng)48小時(shí)。將產(chǎn)物溶于DMSO，于室溫在去離子水中透析，冷凍干燥獲得PG-PLA。以DMSO-d₆作為溶劑，對(duì)PG-PLA進(jìn)行¹HNMR核磁圖譜分析。采用KBr壓片紙樣法對(duì)PG-PLA作傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)分析。采用四氫呋喃作為溶劑，應(yīng)用體積-排除色譜偶聯(lián)多角激光散射(SEC-MALLS)法檢測(cè)PG-PEI分子量。以數(shù)碼熔點(diǎn)儀測(cè)定PG-PLA的熔點(diǎn)。經(jīng)檢測(cè)，該殼層基本成分為聚甘油醇和聚乳酸，分子量為1.08×10⁵Da，玻璃化溫度為62℃

在75℃下將0.2mgPG-PLA熔化分散至1.5mL去離子水。在梯度下降的溫度下用馬爾文公司的粒徑儀測(cè)定顆粒粒徑、Zeta-電位和導(dǎo)電率。

2PG-PLA/PEI25k復(fù)合物的檢測(cè)