[發明專利]應用pH敏感的比率熒光蛋白檢測酶-前藥反應的方法

在審

• 申請號: 201310642001.1
• 申請日: 2013-12-03
• 公開（公告）號: CN103630519A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 王平;曹曉丹;劉蕙
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及一種應用pH敏感的比率熒光蛋白檢測酶-前藥反應的方法。

背景技術

在現有的科學技術和醫療水平的條件下，人類治療腫瘤的主要方法是化療?；熓抢每鼓[瘤藥物治療腫瘤，臨床應用始于上世紀40年代，隨著腫瘤細胞動力學和臨床藥理學的發展，以及各種抗腫瘤藥物的問世，加上采用聯合化療和成熟的化療方案，有少數腫瘤可以治愈，如急性淋巴細胞白血病、何杰金病等。近十年來，國內外開始研究生物反應調節劑和誘導分化劑等類藥物，與抗腫瘤藥物有機配合，提高了療效和減輕化療藥物的毒副反應，大大加速了腫瘤化療學的發展。但這一療法存在以下的缺陷：①腫瘤部位藥物濃度不足；②系統毒性；③對腫瘤細胞缺乏高于正常細胞的敏感性；④出現耐藥腫瘤細胞。這些缺陷使得腫瘤治療無法徹底解決安全問題。

抗體導向酶-前藥療法(antibody-directed?enzyme?prodrug?therapy，ADEPT)是將腫瘤相關單克隆抗體與激活前藥的酶相連形成一種靶向腫瘤組織的抗體-酶復合物，然后給予前藥，與定位在腫瘤表面的酶將前藥活化為毒性藥物，在腫瘤細胞中產生細胞毒性效應。酶-前藥療法克服了在腫瘤治療過程中的腫瘤部位藥物的低濃度和系統毒性的缺點，將酶的高效性與前藥的低毒性相結合，開辟了腫瘤治療的新領域。前藥在設計過程中，是在原來腫瘤藥物結構基礎上添加基團，這些基團在反應過程中會存在pH的變化，因此，需要通過有效的途徑來靈敏檢測pH的變化過程。現有技術中，一般檢測pH變化是應用pH計。但是，精密pH計檢測pH變化時存在滯后的現象，在實時檢測方面增加了難度。

發明內容

本發明的目的在于提供一種應用pH敏感的比率熒光蛋白檢測酶-前藥反應的方法。

在本發明的第一方面，提供一種檢測辣根過氧化物氧化酶(HRP)-吲哚-3-乙酸(IAA)反應中pH變化的方法，所述方法包括：

(1)在辣根過氧化物氧化酶(HRP)-吲哚-3-乙酸(IAA)反應體系中，加入pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins；

(2)根據pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins的熒光強度變化來確定反應過程中的pH變化。

在另一優選例中，所述的方法是體外方法。

在另一優選例中，所述的pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins的基因序列如SEQ?ID?NO:1所示。

在另一優選例中，步驟(2)中，利用熒光酶標儀測定不同時間點上，pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins在激發波長397nm/發射波長507nm的熒光強度值除以激發波長483nm/發射波長507nm的熒光強度值，獲得的比值的前后變化代表了pH值發生變化。

在另一優選例中，還包括：將獲得的比值與標準曲線進行比較；其中，所述的標準曲線通過將pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins置于已知pH值的緩沖液中，測定其在激發波長397nm/發射波長507nm的熒光強度值除以激發波長483nm/發射波長507nm的熒光強度值的比值；將該比值與相應的已知pH值作圖獲得。

在另一優選例中，所述反應體系中，pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins的終濃度是300±200μg/ml；較佳地是300±100μg/ml；較佳地是300±50μg/ml；更佳地是300±20μg/ml。

在另一優選例中，所述的pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins的制備方法包括：將SEQ?ID?NO:1所示的基因序列插入到pET15b載體中，轉化大腸桿菌，誘導表達，破碎菌體，純化獲得pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins。

在另一優選例中，所述的反應體系中，反應介質是水(純水)或緩沖液；較佳地是水(純水)。

在本發明的另一方面，提供pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins的用途，用于檢測辣根過氧化物氧化酶(HRP)-吲哚-3-乙酸(IAA)反應中pH變化。

本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、通過AKTA的咪唑濃度梯度洗脫模式純化目的蛋白曲線圖。藍線：UV值；綠線：咪唑濃度增長值；A峰：上清液流穿柱子峰；B峰：目的蛋白洗脫峰。從圖1得出目的蛋白pHluorins在咪唑濃度為120mM左右可以被洗脫。