[發明專利]應用pH敏感的比率熒光蛋白檢測酶-前藥反應的方法

在審

• 申請號: 201310642001.1
• 申請日: 2013-12-03
• 公開（公告）號: CN103630519A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 王平;曹曉丹;劉蕙
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

1.一種檢測辣根過氧化物氧化酶-吲哚-3-乙酸反應中pH變化的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)在辣根過氧化物氧化酶-吲哚-3-乙酸反應體系中，加入pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins；

(2)根據pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins的熒光強度變化來確定反應過程中的pH變化。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins的基因序列如SEQ?ID?NO:1所示。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，利用熒光酶標儀測定不同時間點上，pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins在激發波長397nm/發射波長507nm的熒光強度值除以激發波長483nm/發射波長507nm的熒光強度值，獲得的比值的前后變化代表了pH值發生變化。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，還包括：將獲得的比值與標準曲線進行比較；其中，

所述的標準曲線通過將pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins置于已知pH值的緩沖液中，測定其在激發波長397nm/發射波長507nm的熒光強度值除以激發波長483nm/發射波長507nm的熒光強度值的比值；將該比值與相應的已知pH值作圖獲得。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應體系中，pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins的終濃度是300±200μg/ml；較佳地是300±100μg/ml；較佳地是300±50μg/ml；更佳地是300±20μg/ml。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins的制備方法包括：將SEQ?ID?NO:1所示的基因序列插入到pET15b載體中，轉化大腸桿菌，誘導表達，破碎菌體，純化獲得pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反應體系中，反應介質是水或緩沖液。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的反應介質是水。

9.pH敏感的比率熒光蛋白pHluorins的用途，其特征在于，用于檢測氧化物氧化酶-吲哚-3-乙酸反應中pH變化。