[發(fā)明專利]一種快速檢測(cè)牛鸚鵡熱嗜衣原體的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310638514.5
• 申請(qǐng)日: 2013-11-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103981252A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁小軍;馬吉鋒;王建東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧夏農(nóng)林科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種特異、敏感、快速檢測(cè)鸚鵡熱嗜衣原體的TaqMan?MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法。?

背景技術(shù)

動(dòng)物衣原體病(Chlamydiosis)是由各類衣原體感染哺乳動(dòng)物、禽類所發(fā)生的一類十分重要的自然疫源性傳染病。鸚鵡熱衣原體對(duì)各種畜、禽及其他動(dòng)物均有致病性，針對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)，通常造成懷孕4--5個(gè)月的奶牛流產(chǎn)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，如果能早期快速診斷鸚鵡熱衣原體，對(duì)其的防控具有重要意義。?

鸚鵡熱嗜衣原體(Chlamydophila?psittaci，Cps)是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的人獸共患病病原體，能引起人和動(dòng)物多種疾病。Cps對(duì)鳥(niǎo)類、家禽和家畜有很強(qiáng)的感染性，可引起禽類的肺炎、氣囊炎、輸卵管炎及受精率降低和哺乳動(dòng)物流產(chǎn)、死產(chǎn)等生殖系統(tǒng)障礙，是一類十分重要的自然疫源性傳染病，呈地方流行。牛衣原體病是由鸚鵡熱衣原體感染牛引起的一種多癥狀性傳染病，主要表現(xiàn)為妊娠母牛流產(chǎn)、死產(chǎn)和產(chǎn)弱犢；新生牛多發(fā)生肺炎、腸炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、腦炎和結(jié)膜炎；種公牛發(fā)生睪丸炎等，對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成很大危害及經(jīng)濟(jì)損失。?

目前針對(duì)鸚鵡熱衣原體疾病的檢測(cè)主要通過(guò)檢測(cè)病原體是否存在來(lái)作為主要依據(jù)，常用的有碘和Giemsa染色，免疫熒光法，根據(jù)抗原抗體的酶免疫技術(shù)以及靈敏度比較高的PCR技術(shù)。然而針對(duì)PCR反應(yīng)，目前主要體現(xiàn)在MOMP基因、rRNA基因和內(nèi)源性質(zhì)粒這三個(gè)目的片段，內(nèi)源性質(zhì)粒的敏感性和特異性高于MOMP基因、rRNA基因的檢測(cè)，能夠檢測(cè)敏感性達(dá)1fg的質(zhì)粒DNA，rRNA基因能夠檢測(cè)到10fg的總DNA，MOMP基因的敏感性卻為100fg的總DNA，為此我們建立基于TaqMan探針的Real?time?PCR技術(shù)，針對(duì)MOMP基因中的ompA(major?outer?membrane?protein?A，ompA)基因建立快速的、高靈敏的PCR檢測(cè)試劑盒，從而為鸚鵡熱衣原體感染檢測(cè)提供強(qiáng)有力的技術(shù)保障。?

本研究選取的是衣原體ompA基因保守的序列，設(shè)計(jì)了針對(duì)鸚鵡熱衣原體種屬的特異性引物和TaqMan?MGB探針，通過(guò)摸索選用了優(yōu)化后的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件和擴(kuò)增體系，提高了檢測(cè)的特異性和敏感性，建立了TaqMan?MGB探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)鸚鵡熱衣原體的方法，并將其固相化集成快速檢測(cè)試劑盒，敏感性為10fg的總DNA，同時(shí)不與沙眼衣原體55Y120株、肺炎衣原體AR39株、沙眼衣原體、肺炎衣原體、牛結(jié)核分枝桿菌、布魯士桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、乳鏈球菌、肺炎克雷伯桿菌和沙門(mén)氏菌發(fā)生交叉反應(yīng)，具有較強(qiáng)的特異性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床診斷，鸚鵡熱衣原體的檢測(cè)尚缺乏這方面的試劑盒，因此，我們建立鸚鵡熱衣原體ompA基因的簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確經(jīng)濟(jì)、靈敏度高的TaqMan?MGB探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，為鸚鵡熱衣原體感染的早期診斷提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持，對(duì)鸚鵡熱衣原體感染的防控具有重要意義。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及一種特異、敏感、快速檢測(cè)鸚鵡熱嗜衣原體的TaqMan?MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法。本發(fā)明涉及的陽(yáng)性株鸚鵡熱衣原體SX5株(牛源)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蘭州畜收獸醫(yī)研究所分離保存；沙眼衣原體55Y120和肺炎衣原體AR39株由中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏管理中心提供；Hela細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室保存。?

本發(fā)明涉及的敏感性檢測(cè)顯示：標(biāo)準(zhǔn)菌株總DNA進(jìn)過(guò)稀釋，最大DNA濃度為1μg，最小DNA濃度為1fg，每個(gè)樣3次重復(fù)，結(jié)果顯示1fg的總DNA在兩臺(tái)儀器中都無(wú)擴(kuò)增曲線，說(shuō)明最大靈敏度為總DNA10fg。兩臺(tái)儀器都顯示出良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，IQ5儀器的相關(guān)系數(shù)R2＝0.996，LightCycler的相關(guān)系數(shù)R2＝0.0.993，溶解曲線峰值單一，IQ5儀器的Tm＝74.3℃，LightCycler的Tm＝74.1℃。?

本發(fā)明涉及的特異性檢測(cè)顯示：對(duì)陽(yáng)性鸚鵡熱衣原體SX5株、沙眼衣原體55Y120株、?