[發(fā)明專利]一種宮頸上皮內(nèi)瘤變細胞的體外培養(yǎng)方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310637730.8
• 申請日: 2013-12-04
• 公開（公告）號: CN103602630A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發(fā)明（設計）人: 劉玉珍
• 申請（專利權(quán)）人: 劉玉珍
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及一種細胞培養(yǎng)方法，尤其涉及一種宮頸上皮內(nèi)瘤變細胞的培養(yǎng)方法。

背景技術

宮頸癌是世界范圍內(nèi)最常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)生是一個由癌前病變逐漸衍變?yōu)榘┑倪^程，時間可以從數(shù)年到數(shù)十年。這種癌前變化代表了一系列組織學異常的宮頸上皮細胞，故又稱為宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cervical?intraepithelial?neoplasia，CIN)。根據(jù)細胞異常的程度，CIN又進一步分為CINI(輕度不典型增生)，CINII(中度不典型增生)和CINIII(重度不典型增生和原位癌)。CINI在大多數(shù)情況下會自然消退，因此，事實上不屬于癌前病變的范疇；但是CINII和CINIII往往持續(xù)存在，其中20％～45％未經(jīng)治療CINII／III會進一步發(fā)展成宮頸癌，因此，CINII和CINIII被認為是高級別病變和宮頸癌前病變。研究認為，幾乎所有高級別CIN都是由致癌性人乳頭瘤病毒(Human?papillomavirus，HPV)的持續(xù)感染引起的，而長期的病毒感染是CIN進一步發(fā)展的必要條件，但是，病毒沒有自己獨立的代謝系統(tǒng)，必須寄生在宿主細胞中才能繁殖，因此，HPV不能在進行細胞外培養(yǎng)。在CIN生物學特性的體內(nèi)外研究中，培養(yǎng)自然HPV感染的CIN細胞具有重要意義。

由于技術和方法的問題，人CIN細胞的體外培養(yǎng)及特性等研究仍然很不成熟，特別是標本的大小問題。宮頸發(fā)生瘤變的組織往往較小，進行分離后很難得到足夠的CIN細胞進行培養(yǎng)。到目前為止，只有兩篇文獻對CIN細胞的分離及培養(yǎng)方法進行了描述。其中一項研究中采用的是“組織塊培養(yǎng)法”，對整塊病變組織進行顯微鏡下分割后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，收集從組織塊中長出的角質(zhì)細胞并接種到滅活的小鼠成纖維細胞滋養(yǎng)層上。該種方法的主要缺點在于經(jīng)過輻射處理的小鼠滋養(yǎng)層細胞有病毒感染等潛在風險。此外，角質(zhì)細胞收集的數(shù)量較少，且容易在培養(yǎng)中被快速生長的成纖維細胞所污染。另一項研究中，將CIN組織用II型膠原酶消化后接種到含有10％胎牛血清(Fetal?bovine?serum，F(xiàn)BS)的DMEM-F12培養(yǎng)基中，與成纖維細胞共同培養(yǎng)。該培養(yǎng)方法的缺點在于培養(yǎng)方法相對復雜，培養(yǎng)過程中需剪除培養(yǎng)瓶上層，增加污染的風險，同時所需時間較長，需要五周傳代。此外，培養(yǎng)基中的FBS增加了成纖維細胞污染的風險以及角質(zhì)細胞的分化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種成活率及純度高且傳代后細胞生物學特性無明顯改變(即細胞無明顯分化)，攜帶HPV的宮頸上皮內(nèi)瘤變細胞的體外培養(yǎng)方法。

為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案是：一種宮頸上皮內(nèi)瘤變細胞的體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

步驟一，取小塊人宮頸瘤變組織，小部分進行HPV分型檢測，部分進行培養(yǎng)；

步驟二，用I型膠原酶消化分解后制成細胞懸液；

步驟三，利用臺盼藍拒染法對細胞的活性進行判定；

步驟四，將細胞懸液接種到低胎牛血清培養(yǎng)基且經(jīng)鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中，等待細胞貼壁；

步驟五，細胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)基對宮頸上皮內(nèi)瘤變細胞進行純化，每周更換至少兩次培養(yǎng)液，待細胞融合至80％～85％后傳代。

步驟六，通過免疫熒光檢測對細胞進行鑒定，通過PCR對HPV進行分型檢測。

作為一種優(yōu)選的技術方案，在上述步驟一中，用3％～5％醋酸和盧格氏碘溶液標記病變組織，在陰道鏡引導下活檢鉗鉗取宮頸上皮內(nèi)瘤變組織約2～3mm³，在甲硝唑液體中浸泡4～6分鐘，將宮頸上皮內(nèi)瘤變組織取出后置于轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中3℃～5℃低溫保存。

作為一種優(yōu)選的技術方案，所述轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基含有2000U／ml青霉素、2000ug／ml鏈霉素和5ug／ml兩性霉素。

作為一種優(yōu)選的技術方案，在上述步驟二中，取出宮頸上皮內(nèi)瘤變組織放入陪替氏培養(yǎng)基中；在無菌條件下，將宮頸上皮內(nèi)瘤變組織用含有青霉素、鏈霉素和兩性霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2～4次；

將宮頸上皮內(nèi)瘤變組織剪碎，加入預熱至36℃～38℃的I型膠原酶，然后將其移入無菌離心管中，用I型膠原酶沖洗陪替氏培養(yǎng)基并將沖洗液加入同一離心試管中；將離心試管放在置于電熱恒溫振蕩器中，慢慢攪動25～35min，用吸液管吹打離散1～3min；

然后用吸液管吸取含有單個細胞的液體，用200目篩網(wǎng)過濾至無菌離心管中；用PBS沖洗離心管后將沖洗液過濾至同一離心管中；將含有單細胞懸液的離心管放置臺式離心機上，以1000r／min離心4～6min；