[發明專利]一種宮頸上皮內瘤變細胞的體外培養方法

無效

• 申請號: 201310637730.8
• 申請日: 2013-12-04
• 公開（公告）號: CN103602630A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 劉玉珍
• 申請（專利權）人: 劉玉珍
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種宮頸上皮內瘤變細胞的體外培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一，取小塊人宮頸瘤變組織，小部分進行HPV分型檢測，部分進行培養；

步驟二，用I型膠原酶消化分解后制成細胞懸液；

步驟三，利用臺盼藍拒染法對細胞的活性進行判定；

步驟四，將細胞懸液接種到低胎牛血清培養基且經鼠尾膠原包被的培養瓶中，等待細胞貼壁；

步驟五，細胞貼壁后更換無血清培養基對宮頸上皮內瘤變細胞進行純化，每周更換至少兩次培養液，待細胞融合至80％～85％后傳代；

步驟六，通過免疫熒光檢測對細胞進行鑒定，通過PCR對HPV進行分型檢測。

2.如權利要求1所述的一種宮頸上皮內瘤變細胞的體外培養方法，其特征在于，在上述步驟一中，用3％～5％醋酸和盧格氏碘溶液標記病變組織，在陰道鏡引導下活檢鉗鉗取宮頸上皮內瘤變組織約2～3mm³，在甲硝唑液體中浸泡4～6分鐘，將宮頸上皮內瘤變組織取出后置于轉移培養基中3℃～5℃低溫保存。

3.如權利要求2所述的一種宮頸上皮內瘤變細胞的體外培養方法，其特征在于，所述轉移培養基含有2000U／ml青霉素、2000ug／ml鏈霉素和5ug／ml兩性霉素。

4.如權利要求2所述的一種宮頸上皮內瘤變細胞的體外培養方法，其特征在于，在上述步驟二中，取出宮頸上皮內瘤變組織放入陪替氏培養基中；在無菌條件下，將宮頸上皮內瘤變組織用含有青霉素、鏈霉素和兩性霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2～4次；

將宮頸上皮內瘤變組織剪碎，加入預熱至36℃～38℃的I型膠原酶，然后將其移入無菌離心管中，用I型膠原酶沖洗陪替氏培養基并將沖洗液加入同一離心試管中；將離心試管放在置于電熱恒溫振蕩器中，慢慢攪動25～35min，用吸液管吹打離散1～3min；

然后用吸液管吸取含有單個細胞的液體，用200目篩網過濾至無菌離心管中；用PBS沖洗離心管后將沖洗液過濾至同一離心管中；將含有單細胞懸液的離心管放置臺式離心機上，以1000r／min離心4～6min；

棄上清液，重新加入完全培養液，用吸液管吹打成單細胞懸液；利用細胞計數板對細胞懸液進行細胞計數。

5.如權利要求4所述的一種宮頸上皮內瘤變細胞的體外培養方法，其特征在于：所述PBS中青霉素、鏈霉素和兩性霉素的濃度分別為200U／ml、200ug／ml和5ug／ml。

6.如權利要求1所述的一種宮頸上皮內瘤變細胞的體外培養方法，其特征在于，在上述步驟四中，將細胞分離后的細胞懸液接種在鼠尾膠原包被的培養瓶中，所用完全培養基為含有4％～6％FBS的無血清角質細胞培養基(K-SFM)；將培養瓶放置含4％～6％CO₂且溫度為36℃～38℃的培養箱中培養，等待細胞貼壁。

7.如權利要求6所述的一種宮頸上皮內瘤變細胞的體外培養方法，其特征在于，在上述步驟五中，細胞貼壁后，進行細胞換液，所用完全培養基更換為K-SFM；每周至少2次更換培養液；用倒置顯微鏡觀察細胞的生長狀態；細胞融合至約80％～85％后傳代。

8.如權利要求6所述的一種宮頸上皮內瘤變細胞的體外培養方法，其特征在于，所述培養瓶選用T25培養瓶。