[發明專利]高效純化量子點與IgG類單克隆抗體偶聯物的方法

有效

• 申請號: 201310637480.8
• 申請日: 2013-12-03
• 公開（公告）號: CN103665159A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 熊勇華;許恒毅;羅薇;許楊;魏華;徐威
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C07K16/14
• 分類號: C07K16/14;C07K16/44;C07K16/12;C07K1/13
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及納米材料生物學修飾以及偶聯物純化的新方法。

背景技術

自從1975年應用細胞融合技術首次制備出單克隆抗體以來，雜交瘤技術得到了迅速發展。大量的單克隆抗體被成功制備，并被廣泛應用于免疫學、生物化學、藥理學、細胞生物學、微生物學及臨床等各個領域。目前已制備了小鼠、大鼠及人的雜交瘤細胞株，其中應用最廣泛的仍然是小鼠雜交瘤細胞株。因此，鼠源性IgG類單克隆抗體自然而然地成為了一類最主要且應用最為廣泛的單克隆抗體。該類抗體不僅具有重要的科研價值，而且具有巨大的商業價值。然而，鼠源性IgG類單克隆抗體不具有類似納米材料的光、電等性質，因此在實際應用中往往需要結合其他的一些材料，如熒光物質、有機染料，磁性材料等。

量子點(Quantum?Dots,?QDs)是一種由II-VI或III-V族元素組成的半導體納米晶體?(Semiconductor?nanocrystals)，由于量子點的極小物理尺寸，從而導致了一種量子限域效應，使得量子點顯示出具有比常規有機染料、熒光蛋白更為優越的獨特光學性質。首先，與常規有機染料相比，量子點的激發光譜寬且呈連續分布，其熒光發射光譜的半寬峰高與常規有機染料相比更窄，且呈對稱分布。此外，量子點與常規熒光染料相比，激發和發射光譜之間的斯托克斯位移大，降低了量子點熒光信號的信噪比，大大提高了量子點的檢測靈敏度。單個量子點的熒光強度是羅丹明染料的10-100倍之間，且量子點的熒光發射波長可通過調整量子點合成粒徑的大小以及材料組分進行連續調諧，因此合成不同直徑大小的量子點就能獲得多種可以辨別的不同顏色熒光。由于不同尺寸大小的量子點能夠采用單一波長的激發光產生不同顏色的熒光,?因而可方便實現對生物組分的多元檢測。量子點與常規有機染料或熒光蛋白相比，具有較強的抗光漂白功能。量子點在連續光激發條件下，其熒光發射強度隨時間變化不明顯，而Alexa?488在沒有添加抗漂白劑的情況下熒光強度呈指數下降。總之，作為一種新型的熒光標記物，量子點具有比常規有機染料以及熒光蛋白更為顯著的優勢，目前已廣泛應用于細胞標記、活體細胞成像、活體動物體內熒光顯微成像以及熒光標記的免疫學快速診斷技術等領域。其中羧基功能團表面的水溶性量子點應用最為廣泛，采用多羧基以及疏水鏈的兩性聚合物是油溶性量子點轉化為羧基表面的水溶性量子點最常用方法。然而，量子點并不具有抗體分子的特異性和選擇性，因此往往需要在其表面偶聯上抗體分子形成量子點單克隆抗體偶聯物。這樣，這種偶聯物就同時擁有了量子點的光學特性和抗體分子的特異性和選擇性。

水溶性羧基化量子點與IgG類單克隆抗體常用偶聯方法為EDC/NHSS介導的活潑酯方法。在水溶性羧基化量子點與IgG類單克隆抗體偶聯過程中，將量子點IgG類單克隆抗體偶聯物與溶液中游離IgG類單克隆抗體進行高效分離，是保證量子點IgG類單克隆抗體偶聯物廣泛使用的前提。目前，量子點單克隆抗體偶聯物純化方法主要包括以下幾種。第一，超速離心方法。由于水溶性量子點納米粒子粒徑小，比表面積大，納米材料與單克隆抗體偶聯物表面含有大量的羧基，因此采用常規離心（低于30，000?g離心力），量子點單克隆抗體偶聯物回收效率普遍偏低（小于50%），若要將量子點單克隆抗體偶聯物回收效率提高至85%以上，離心速度一般需大于50，000?g。?第二種，凝膠色譜法。該方法利用量子點單克隆抗體偶聯物與單克隆抗體的分子量差異（表現為光學以及水化粒徑的差異），利用排阻層析原理進行分離。第三種，超濾分離法。該法利用超濾管的超濾膜截流分子量差異將單克隆抗體與量子點單克隆抗體偶聯物進行分離的一種方法。同時還有基于瓊脂糖凝膠以及瓊脂糖-聚丙烯酰胺雜合凝膠電泳等的純化分離方法。總之，利用以上純化方法雖然可以獲得較高質量的量子點單克隆抗體偶聯物，但仍存在操作條件苛刻，流程復雜，得率低等缺陷，很難實現規模化生產。

發明內容

水溶性量子點是一種良好的納米熒光標記材料，該材料通過與單克隆抗體、鏈霉親和素、蛋白A、蛋白G以及配體或受體分子偶聯，可廣泛應用于細胞標記、活體細胞成像、活體動物體內熒光顯微成像以及免疫快速診斷等諸多領域。但是傳統的量子點單克隆抗體偶聯物純化方法存在操作條件苛刻，流程復雜，得率低以及很難實現規模化生產等缺陷。

本發明的目的是提供一種操作簡便、分離效率高、大批量純化水溶性量子點IgG類單克隆抗體的新方法，具體包括以下步驟：