[發明專利]一種快速檢測蝦蟹螺原體膠體金免疫層析試紙條及其制備方法

有效

• 申請號: 201310634981.0
• 申請日: 2013-12-02
• 公開（公告）號: CN103823055B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 王文;安亮;任夢;肖政云;顧偉;孟慶國;任乾
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/532
• 代理公司: 南京知識律師事務所32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，具體涉及一種蝦蟹螺原體膠體金免疫層析檢測試紙條及其制備和在蝦蟹螺原體檢測上的應用。

背景技術

中華絨螯蟹螺原體(Spiroplasma?eriocheiris菌株保藏號CCTCC?M207170^T=DSM21848^T)是一種新型蝦蟹病原，不僅是河蟹“顫抖病”的致病菌，也是引起克氏原螯蝦、南美白對蝦和羅氏沼蝦等水生甲殼動物重大疫病的致病菌，給養殖業帶來巨大損失。目前蝦蟹螺原體病原的檢測可以利用光鏡、電鏡、PCR、ELISA、培養等檢測技術，但這些技術（除ELISA外）都需要相關的儀器、設備和技術，無法在用于現場快速檢測。而我們前期建立的ELISA快速檢測技術，雖然可以用于生產實際的現場快速檢測，但由于操作步驟較多，檢測花費需要3h，操作者還需要進行培訓。所以，需要研制一種更為簡便、快速、廉價和適應性廣的技術，有利于推廣和應用。

膠體金免疫層析技術由于其快速、便捷，不需特殊設備，結果判斷直觀等優勢，越來越受到人們的重視。迄今為止，還未見有蝦蟹螺原體免疫膠體金試紙條方法建立的報道。膠體金免疫試紙條與其他診斷方法相比較，體現出以下特點：①快捷迅速，可在5～15min內顯示結果；②靈敏準確，結果受外因影響較小，可在對蝦養殖場現場進行檢測；③操作簡單，不需要任何特殊儀器和設備，尤其適合在基層推廣應用；④成本低廉，所需樣本和試劑量少；⑤保存和運輸方便，一般保存于4℃冰箱，甚至可常溫保存，而且保存期可以長達2年。本發明利用多克隆抗體和膠體金標記技術建立蝦蟹螺原體膠體金免疫層析快速檢測方法。

發明內容

本發明的目的是以多克隆抗體為基礎，通過免疫膠體金標記技術研制一種操作簡單、成本低廉、快捷迅速的檢測蝦蟹螺原體的膠體金檢測試紙條。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種快速檢測蝦蟹螺原體膠體金免疫層析試紙條，它包括樣品墊、結合墊、硝酸纖維膜、吸收墊、PVC板。其中，所述樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊依次固定在PVC板上；其特征在于所述結合墊是無紡布結合墊，其中噴涂有免疫膠體金顆粒的抗蝦蟹螺原體多克隆抗體，可與樣品中的蝦蟹螺原體發生抗原-抗體特異性結合；所述硝酸纖維素膜包括包被有抗蝦蟹螺原體多克隆抗體的檢測線和包被有羊抗兔IgG抗體的質控線。

一種上述試紙條的制備方法，該方法包括以下步驟：

(1)蝦蟹螺原體多克隆抗體制備：采用經甲醛滅活后的螺原體全菌作為免疫抗原，經4次人工免疫健康的新西蘭大白兔，抽血進行效價測定，分離高效價螺原體多克隆抗體并進行純化；

(2)納米膠體金顆粒的制備：采用檸檬酸三鈉作為還原劑制備40～50nm膠體金溶液，并調整膠體金溶液的pH至8，備用；

(3)制備抗蝦蟹螺原體多克隆抗體的膠體金標記物：在電磁攪拌器下將抗蝦蟹螺原體多克隆抗體緩慢加入備用的膠體金溶液中，蝦蟹螺原體多克隆抗體的質量和膠體金溶液的體積比為0.015：1，經純化和濃縮后形成膠體金標記的蝦蟹螺原體多克隆抗體；

(4)結合墊的制備：結合墊上噴涂的膠體金標記的蝦蟹多克隆抗體的濃度為15ug/ml，噴涂量為30ul/cm²；

(5)抗體固相硝酸纖維素膜的制備：將抗蝦蟹螺原體多克隆抗體包被到硝酸纖維素膜上的檢測線位置作為檢測線捕獲抗體，濃度為1.2mg/ml，包被參數為1μl/cm；抗金標抗體的羊抗兔IgG二抗噴涂到硝酸纖維素膜上的質控線位置作為質控線捕獲抗體，濃度為1.2mg/ml，包被參數為1ul/cm；

(6)將吸收墊、帶有檢測線和質控線硝酸纖維素膜、結合墊、樣品墊、PVC板組裝成膠體金免疫層析檢測試紙條。

其中，步驟⑴抗蝦蟹螺原體多克隆抗體的制備：該多克隆抗體效價分別為1∶16384和1∶65536，用Protein?A親和層析柱純化多克隆抗體，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定抗體濃度并調整為2mg/mL；

將依次粘好的底板材料切成裁切成寬×長為0.3cm×6cm的長條即為蝦蟹螺原體膠體金免疫層析檢測試紙條，包裝備用。

用上述蝦蟹螺原體膠體金免疫層析試紙條檢測的方法，包括：如圖2所示，若將含有蝦蟹螺原體檢測樣品加入隨機抽取組裝的試紙條中，蝦蟹螺原體與金標抗體結合并在層析作用下與T線抗體結合，室溫下作用15min，陽性結果出現兩條紅線，即檢測線T線和質控線C線，T線顯示該樣品中含有蝦蟹螺原體；若檢測樣品中不含有蝦蟹螺原體，陰性結果只在質控線C線出現一條紅線，顯示該樣品中沒有蝦蟹螺原體。