[發(fā)明專利]一種快速檢測蝦蟹螺原體膠體金免疫層析試紙條及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310634981.0
• 申請日: 2013-12-02
• 公開（公告）號: CN103823055B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發(fā)明（設計）人: 王文;安亮;任夢;肖政云;顧偉;孟慶國;任乾
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/532
• 代理公司: 南京知識律師事務所32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種快速檢測蝦蟹螺原體膠體金免疫層析試紙條，其特征在于：該試紙條由樣品墊、結合墊、硝酸纖維膜、吸收墊、PVC板組成，所述樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊依次固定在PVC板上；其特征在于所述結合墊是無紡布結合墊，其中噴涂有免疫膠體金顆粒的抗蝦蟹螺原體多克隆抗體，可與樣品中的蝦蟹螺原體發(fā)生抗原-抗體特異性結合；所述硝酸纖維素膜包括包被有抗蝦蟹螺原體多克隆抗體的檢測線和包被有羊抗兔IgG抗體的質控線。

2.一種制備權利要求1所述的蝦蟹螺原體膠體金免疫層析試紙條的方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：

(1)蝦蟹螺原體多克隆抗體制備及測定：采用經(jīng)甲醛滅活后的螺原體全菌作為免疫抗原，經(jīng)4次人工免疫健康的新西蘭大白兔，抽血進行效價測定，分離高效價螺原體多克隆抗體并進行純化；

(2)納米膠體金顆粒的制備：采用檸檬酸三鈉作為還原劑制備40～50nm膠體金溶液，并調整膠體金溶液的pH至8，備用；

(3)制備抗蝦蟹螺原體多克隆抗體的膠體金結合標記物：在電磁攪拌器下將抗蝦蟹螺原體多克隆抗體緩慢加入備用的膠體金溶液中，蝦蟹螺原體多克隆抗體的質量和膠體金溶液的體積比為0.015：1，經(jīng)純化和濃縮后形成膠體金結合標記的蝦蟹螺原體多克隆抗體；

(4)結合墊的制備：結合墊上噴涂的膠體金結合標記的蝦蟹多克隆抗體的濃度為15ug/ml，噴涂量為30ul/cm²；

(5)抗體固相硝酸纖維素膜的制備：將抗蝦蟹螺原體多克隆抗體包被到硝酸纖維素膜上的檢測線位置作為檢測線捕獲抗體，濃度為1.2mg/ml，包被參數(shù)為1μl/cm，抗結合抗體的羊抗兔IgG二抗噴涂到硝酸纖維素膜上的質控線位置作為質控線捕獲抗體，濃度為1.2mg/ml，包被參數(shù)為1μl/cm；

(6)將吸收墊、帶有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜、結合墊、樣品墊、PVC板組裝成膠體金免疫層析檢測試紙條。

3.根據(jù)權利要求2所述的蝦蟹螺原體膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于所述（1）步驟蝦蟹螺原體多克隆抗體效價分別為1∶16384和1∶65536，用Protein?A親和層析柱純化多克隆抗體，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定抗體濃度并調整為2mg/mL。

4.根據(jù)權利要求3所述的蝦蟹螺原體膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于所述（5）步驟檢測線與控制線之間的間隔為5.0mm。