[發明專利]手足口病病毒等溫擴增檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310633713.7
• 申請日: 2013-11-28
• 公開（公告）號: CN103757130A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 彭濤;龍飛;蘇文瀚;肖靜;殷仙麗;盧然如
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院;佛山市燁泰科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市越秀區海心聯合專利代理事務所(普通合伙) 44295
• 代理人: 任琳

技術領域

本發明公開了一種測試手足口病的劑盒，具體地說，是一種檢測手足口病病毒EV71的等溫擴增試劑盒。

背景技術

腸道病毒71型（英文名為：Human?enterovirus71），簡稱EV71，是引起嬰幼兒手足口病主要病原體之一，EV71以其高致病性、高死亡率奪去了很多人的生命，根據中國疾病預防控制中心公布的統計數據表明，自2009年以來，手足口病發病率和死亡率呈逐年上升趨勢，并連續3年成為我國丙類傳染病發病率和死亡率最高的疾病。診斷、治療和預防是應對和處置重要傳染病的三個關鍵環節，而早期診斷最為關鍵，是有效治療的基礎，也是制定預防策略的依據，因此開發針對EV71病毒的快速診斷試劑盒就顯得尤為迫切和重要。

現有的快速檢測技術主要有兩類：第一類為免疫學方法，包括酶聯免疫吸附法、免疫熒光法、同位素標記抗體法、乳膠凝集法、免疫傳感器法、免疫擴散法及免疫色譜法等；第二類是以核酸為基礎的分子生物學方法，主要有核酸探針法和聚合酶鏈反應法（Polymerase?Chain?Reaction，PCR）。其中的PCR方法是核酸擴增技術的典型代表，該技術是由美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullin等人于1985年發明的，在過去的二十年里，PCR技術作為分子生物學的核心得到了迅猛的發展和應用，特別是在疾病的臨床診斷中，PCR技術以其快速、靈敏和特異的優勢，不僅日益取代了傳統的診斷方法，而且使以往無法完成的診斷成為了可能。

盡管PCR技術長期以來占據著核酸擴增壟斷技術的地位，新近研發的一系列等溫核酸擴增檢測技術正逐漸成為PCR技術的替代技術而被廣泛應用。與PCR技術相比，核酸等溫擴增技術的特點是可在特定溫度條件下實現核酸的擴增。由于擴增反應的全過程均在同一溫度下進行，使它們對儀器的要求大大簡化，可通過加熱模塊、水浴槽等簡單的，甚至是非專業的設備完成反應。目前常用的等溫技術有以下幾類：

1、依賴核酸序列擴增（Nucleic?acid?sequence-based?amplification，NASBA）

2、自主序列復制（Self-sustained?Sequence?Replication，3SR）

3、轉錄介導擴增（Transcription?mediated?amplification，TMA）

4、單引物等溫擴增技術（Single?Primer?Isothermal?Amplification，SPIA）

5、滾環擴增技術（rolling?circle?amplification，RCA）

6、環介導的等溫擴增技術（loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP）

7、鏈替代擴增技術（Strand?displacement?amplification，SDA）

這些核酸擴增技術（PCR技術、等溫擴增技術等）的擴增產物為DNA或RNA，與之相對應的擴增產物檢測方法主要有以下幾種：

電泳分析：常規變性凝膠電泳后用EB或SYBR?GreenⅠ染色，在1%-1.5%瓊脂糖凝膠中可以輕易識別。目前該方法已很少使用；

雜交技術：產物通過與特異性探針標記的序列雜交，如32P標記的寡核苷酸序列與擴增產物進行Northern雜交以檢測擴增產物；

酶聯凝膠（enzyme-linked?gel?assay，ELGA）技術：用非放射性的辣根過氧化物酶（HRP）標記的探針檢測擴增產物。未雜交的探針通過在垂直凝膠電泳中得以分離，然后將凝膠置于有HRP底物的溶液中孵育，則可目測反應結果；

電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）技術：5’端標記有生物素的捕獲探針將擴增產物固定在鏈霉親和素結合的磁珠上，下游引物的5’末端含有和釘標電化學發光檢測探針互補的序列。擴增產物與ECL探針形成復合物，攜帶該復合物的磁珠被電極的表面磁性捕獲。電極上的電壓引起電化學發光（ECL）反應。已雜交上的釘標磁珠發出的光和擴增反應產生的RNA擴增產物總量成比例對應，由此可以對擴增產物進行檢測和定量；