[發明專利]手足口病病毒等溫擴增檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310633713.7
• 申請日: 2013-11-28
• 公開（公告）號: CN103757130A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 彭濤;龍飛;蘇文瀚;肖靜;殷仙麗;盧然如
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院;佛山市燁泰科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市越秀區海心聯合專利代理事務所(普通合伙) 44295
• 代理人: 任琳

1.一種手足口病病毒等溫擴增檢測試劑盒，包括：1）等溫擴增反應液、陽性質控標準品，和2）分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒；其特征在于，所述的等溫擴增反應液由等溫擴增緩沖液、反應酶、正、反向引物、分子信標組成；

其中：

所述的正向引物的堿基序列為SEQ?ID?No.1：

ACACAGGTGAGCAGTCATCG；

所述的反向引物的堿基序列為SEQ?ID?No.2：

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGTCTCAATCATGCTCTCATCACT；

所述的分子信標的堿基序列為SEQ?ID?No.3：

CCTTGGACAGGTAAGGTTCCAGCACTCCAAGG。

2.根據權利要求1所述的手足口病病毒等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述的等溫擴增緩沖液包括Tris?HCl40mM、KCl70mM，MgCl₂12mM，DTT10mM，dNTP1mM，rNTP2mM，山梨糖醇375mM。

3.根據權利要求1所述的手足口病病毒等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述的反應酶由T7RNA聚合酶、AMV逆轉錄酶、RNA酶H組成。

4.根據權利要求1所述的手足口病病毒等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽性質控標準品為重組質粒pET-32a。

5.根據權利要求1所述的手足口病病毒等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽性質控標準品的濃度為10⁵copies/反應～10²copies/反應。

6.根據權利要求3所述的手足口病病毒等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述的T7RNA聚合酶的酶活力32U，AVM聚合酶的酶活力6.4U、RNA酶H的酶活力0.08U。

7.根據權利要求1所述的手足口病病毒等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述的分子信標熒光報告基團為FAM，熒光淬滅基團為BHQ1。

8.根據權利要求1所述的手足口病病毒等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述的分子信標使用濃度為100nM。

9.根據權利要求1所述的手足口病病毒等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述的等溫擴增反應的條件為：65℃5min、42℃5min預處理，加入酶液42℃反應90分鐘。

10.根據權利要求1所述的手足口病病毒等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽性質控標準品的構建方法是采用PCR方法對EV71cDNA模板進行擴增，得到所需的EV71VP1基因序列，序列片段經雙酶切后與相應雙酶切pET-32a質粒載體進行連接，用氯化鈣法轉化大腸桿菌，挑選陽性克隆，并進行雙酶切驗證以獲得所需的陽性質控樣品。