[發(fā)明專利]基于轉錄組測序開發(fā)綠豆SSR引物的方法

有效

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• 申請日: 2013-11-29
• 公開（公告）號: CN103642912A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發(fā)明（設計）人: 陳紅霖;程須珍;王素華;王麗俠
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)科學院作物科學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物學及生物信息學，具體地說，涉及一種基于轉錄組測序開發(fā)綠豆SSR引物的方法。?

背景技術

綠豆（Vigna?radiata）是一種豆科、蝶形花亞科豇豆屬植物，原產印度、緬甸地區(qū)。現在東亞各國普遍種植，非洲、歐洲、美國也有少量種植，中國是綠豆[Vigna?radiata(L.)Wilczek]的發(fā)源地之一，擁有類型繁多的綠豆品種資源。中國、緬甸等國是主要的綠豆出口國。由于其生育期短、適應性廣,且具有較好的固氮能力，所以是種植業(yè)資源合理配置、倒茬輪作、間作套種、減災救災不可缺少的糧食作物及貧困地區(qū)農民致富的重要經濟作物；同時綠豆富含蛋白、中淀粉及低脂肪，是理想的營養(yǎng)保健食品。種子和莖被廣泛食用，具有豐富的營養(yǎng)價值。綠豆還可產成多種食品如鮮食豆芽、綠豆粉絲、綠豆粉皮、綠豆酒、綠豆糕等食品，在國際市場上備受青睞。近年來，國際市場對綠豆的需求量和全世界綠豆的生產量均有所增加，現今中國的綠豆年出口量在20-30萬噸，出口價格一般400-500美元。綠豆的社會經濟價值不容忽視。然而，與大宗作物如玉米、水稻相比，國內外對綠豆的研究還相當滯后，單產仍處于較低水平，分子水平的研究更顯薄弱。?

分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，能在DNA水平上反映植物遺傳基礎的差異，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。簡單重復序列(SSR)廣泛分布于各類真核生物基因組的不同位置，由于SSR的重復次數不同和重復程度不同，使其呈現高度的多態(tài)性。與其它分子標記技術相比，SSR標記具有多態(tài)信息含量高、共顯性遺傳、技術簡單、重復性好、特異性強、操作便利、?并在基因組中分散分布等優(yōu)點已成為最受人們歡迎的分子標記之一，被認為是可靠性最高的分子標記類型之一。在許多領域廣泛應用。但SSR標記的主要缺點是首先要從該物種中獲取重復序列兩側的序列信息，并設計引物，而后才能被利用。?

SSR標記可分為基因組SSR(gSSR)和表達序列標簽SSR(EST-SSR)，EST-SSR標記源于基因的轉錄區(qū)，與gSSR標記相比，其多態(tài)性可能與基因功能直接相關，因此，比gSSR標記具有更高通用性，更經濟，更高效率。利用第二代測序技術可以對全基因組范圍內的轉錄本進行大規(guī)模的高通量測序，并能產生較之EST測序更為海量的轉錄組數據，這為功能基因組SSR標記的開發(fā)提供了更豐富和極有價值的可利用資源。?

轉錄組序列的數量與日俱增，使得通過數據庫搜尋法獲得SSR成為可能。但是從第二代測序技術產生的數據往往極其巨大，對大量的EST序列進行格式處理，剔除冗余序列等仍是一個不小的工作量。Perl是一種自由且功能強大的編程語言。它被用作Web編程、數據庫處理、XML處理以及系統(tǒng)管理等。隨著生物信息學的發(fā)展，Perl更多的應用到了生物數據的操作和檢索中，使得對大批量數據統(tǒng)一處理成為可能。在此基礎上進行EST-SSR引物開發(fā)更能提高分離效率，節(jié)約時間和資金。?

目前綠豆尚無全基因組序列信息，綠豆SSR引物數量較少。對于無參考基因組的轉錄組分析，可先將測序所得的序列拼接成轉錄本，以轉錄本為參考序列，進行后續(xù)分析。利用第二代高通量測序技術獲得綠豆內某一材料的轉錄組序列信息，批量開發(fā)SSR引物的技術成熟，將會對綠豆重要性狀基因的定位、克隆及分子標記輔助選擇育種和比較基因組學研究等起重要推動作用。?

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種基于轉錄組測序開發(fā)綠豆SSR引物的?方法。?

為了實現本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種基于轉錄組測序開發(fā)綠豆SSR引物的方法，所述方法包括以下步驟：?

1）構建轉錄組文庫：提取綠豆葉片總RNA，分離出mRNA，反轉錄并合成雙鏈cDNA，純化cDNA，在cDNA末端添加腺嘌呤核苷并連接測序接頭，然后通過瓊脂糖凝膠電泳回收200-700bp片段，對回收片段進行PCR擴增，即構建得到轉錄組文庫；?

2）對上述轉錄組文庫進行測序，利用軟件Trinity將測序序列拼接成一個完整的轉錄組，取每條基因中最長的轉錄本作為Unigene，并對Unigene序列進行生物信息學分析；?

3）采用軟件MISA1.0對上述Unigene進行SSR檢測；?

4）采用軟件Primer3進行SSR引物設計，并鑒定SSR引物的多態(tài)性。?

其中，步驟1）中所述測序接頭為：?