[發(fā)明專利]基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)綠豆SSR引物的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310629710.6
• 申請日: 2013-11-29
• 公開（公告）號: CN103642912A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳紅霖;程須珍;王素華;王麗俠
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)綠豆SSR引物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫：提取綠豆葉片總RNA，分離出mRNA，反轉(zhuǎn)錄并合成雙鏈cDNA，純化cDNA，在cDNA末端添加腺嘌呤核苷并連接測序接頭，然后通過瓊脂糖凝膠電泳回收200-700bp片段，對回收片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即構(gòu)建得到轉(zhuǎn)錄組文庫；

2）對上述轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行測序，利用軟件Trinity將測序序列拼接成一個完整的轉(zhuǎn)錄組，取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene，并對Unigene序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；

3）采用軟件MISA1.0對上述Unigene進(jìn)行SSR檢測；

4）采用軟件Primer3進(jìn)行SSR引物設(shè)計，并鑒定SSR引物的多態(tài)性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）中所述測序接頭為：

5′RNA?Adapter：5′-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3′

3′RNA?Adapter：5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2）中所述軟件Trinity的版本為v2012-10-05；參數(shù)設(shè)置：min_kmer_cov為2，其它參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2）中所述生物信息學(xué)分析包括但不限于基因注釋、CDS預(yù)測和差異表達(dá)基因篩選。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因注釋包括基因表達(dá)量注釋和/或基因功能注釋。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述差異表達(dá)基因篩選包括GO功能顯著性富集分析和/或Pathway顯著性富集分析。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4）中用于鑒定SSR引物多態(tài)性的綠豆選自中國中綠1號、中綠5號；泰國VC2778A、TC1966；俄羅斯1810、1865；澳大利亞ACC814、ACC41中的至少一種。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4）中進(jìn)行SSR引物設(shè)計使用的參數(shù)為：引物長度18-22bp，Tm55-65℃，產(chǎn)物大小100-300bp。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述方法開發(fā)的綠豆SSR引物，其特征在于，所述SSR引物的序列如SEQ?ID?No.1-64所示。

10.權(quán)利要求9所述綠豆SSR引物在綠豆分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。