[發(fā)明專利]發(fā)酵生產(chǎn)9-OH-AD的恥垢分枝桿菌、菌劑、制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310628652.5
• 申請日: 2013-11-28
• 公開（公告）號: CN103667126A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉喜榮
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南新合新生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P33/00;C12R1/34
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務(wù)所 43008
• 代理人: 趙洪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)甾體激素的菌株和制備方法，具體是一種發(fā)酵生產(chǎn)9-OH-AD的恥垢分枝桿菌、菌劑、制備方法和應(yīng)用。?

背景技術(shù)

近代，有關(guān)使用微生物法轉(zhuǎn)化植物甾醇制備甾體中間體的研究成果被廣泛報(bào)道和研究，相關(guān)報(bào)道最早可追溯到1937年，Mamoli和Vercellone發(fā)表的兩篇專利Ber.70470和Ber.70,2079，在專利中，他們針對使用酵母菌將17-羰基還原為17-β-羥基進(jìn)行了闡述。此后，peterson和Murray在US?Pat.No.2602769中闡述了黃體酮11位α羥基化。1972年，Kraychy等在US?Pat.No.3684657闡述了用Mycobacterium?SP.NRRL?B-3683降解17位脂肪鏈制備4-AD,ADD的方法。1973年，Marsheck等在專利US?Pat.No.3759791中闡述了用?

Mycobacterium?SP.NRRL?B-3805,以膽甾烷等17位有8個以上碳原子的甾體原料制備4-AD。?

9-OH-AD是制備可的松的重要中間體，迄今為止，有很多文獻(xiàn)報(bào)道了9-OH-17-羰基相關(guān)甾體特別是9-OH-AD的制備方法，US?patent4397947報(bào)道了用諾卡氏菌轉(zhuǎn)化4-AD到9-OH-AD的方法，EP-A-0027829報(bào)道了用Corynespora?cassicola菌轉(zhuǎn)化4-AD到9-OH-AD的方法。1977年Merle?G.等在US?Pat.No.40352236中闡述了由植物甾醇制備9-OH-AD的過程。US?patent3759791報(bào)道了使用分支桿菌，以甾醇為底物制備9-OH-AD的方法。1988年，專利GB2197869報(bào)道了由Mycobacterium?roseum，以甾醇為底物制備9-OH-AD的方法，重量收率28.5%，1986年，EP0322081B1中，Slijkhuls等闡述了使用菌種Mycobacterium?species?CBS482.86將甾醇轉(zhuǎn)化9-OH-AD的實(shí)例，其投料量約1.3%(90%含量)，轉(zhuǎn)化216小時，HPLC重量收率42.1%。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種發(fā)酵植物甾醇生產(chǎn)9-OH-AD的恥垢分枝桿菌，菌劑，制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明生產(chǎn)9-OH-AD的重量收率高，發(fā)酵效率高。?

本發(fā)明所使用底物為植物甾醇，菌株為恥垢分枝桿菌NK-XHX-118（Mycobacterium?smegmatis?NK-XHX-118），保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCC?NO：M2013544。?

上述恥垢分枝桿菌（Mycobacterium?smegmatis）CCTCC?NO：M2013544通過自行采集得到的恥垢分枝桿菌（Mycobacterium?smegmatis）CD116誘變培育得到。?

誘變過程如下：?

1、原始菌株為恥垢分枝桿菌（Mycobacterium?smegmatis）CD116，該菌株能夠降解植?物甾醇，于堆積植物甾醇場地附近的土壤中篩選得到。?

將原始菌株在30℃培養(yǎng)，180rpm培養(yǎng)，培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，氯化鈉0.5%，酵母膏0.1%，丙酸鈉0.05%，pH值用10%氫氧化鈉溶液調(diào)至7.0，121℃滅菌30分鐘。?

當(dāng)菌體密度生長至5×108個/ml，離心，菌體用pH=5.6，0.1mol/L無菌檸檬酸鈉溶液沖洗，并用檸檬鈉溶液將菌體稀釋到原來的體積，再加入亞硝基胍，亞硝基胍濃度：60μg/ml，菌懸液于37℃水浴半小時，再次離心，菌體用等量的0.1mol/L，pH=7的磷酸緩沖液沖洗。最后，菌體重新在0.1mol/L，pH=7的磷酸緩沖液中懸浮分散，得誘變后的菌懸液。?

2、菌株篩選?

初篩培養(yǎng)基：葡萄糖1%,磷酸氫二鈉0.4%，磷酸二氫鉀0.4%，七水硫酸鎂0.03%，七水硫酸亞鐵0.005%，瓊脂2%，pH=7.5，培養(yǎng)基121℃滅30min。?

復(fù)篩培養(yǎng)基：9-OH-AD0.2%,磷酸氫二鈉0.4%，磷酸二氫鉀0.4%，七水硫酸鎂0.03%，七水硫酸亞鐵0.005%，瓊脂2%，pH=7.5。培養(yǎng)基121℃滅30min。?

將誘變后的菌懸液進(jìn)行稀釋涂布，培養(yǎng)基采用初篩培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)7天。挑取單菌落接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中，凡是在復(fù)篩培養(yǎng)基中不能生長的菌體，用初篩培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)純化，得到誘變后的菌株。?