[發(fā)明專利]檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310628630.9
• 申請日: 2013-11-29
• 公開（公告）號: CN103695561A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳金頂;毛晶丹;鄧潔汝;勾紅潮;裴晶晶;姚俊庸;葉佐東
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市華學知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞;楊曉松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒及應(yīng)用。?

背景技術(shù)

流行性乙型腦炎（Japanese?encephalitis，JE）是由流行性乙型腦炎病毒（Japanese?encephalitis?virus，JEV）引起的一種重要的蚊媒性人畜共患傳染病。JEV是引起母豬出現(xiàn)繁殖障礙的主要病原體之一，對豬的致死率不高，但可引起懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或木乃伊胎，也可引起公豬的睪丸急性炎癥反應(yīng)或不育，給養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)發(fā)展造成較大的經(jīng)濟損失。因此，防制豬JE不僅可以減少養(yǎng)豬業(yè)的損失，而且對人類的健康發(fā)展有重要意義。?

流行性乙腦病毒首先于1953年在日本從患者腦組織中分離獲得，因此稱日本腦炎病毒（Japanese?encephalitis?virus,JEV），所致疾病在日本稱日本乙型腦炎（JBE）。1950年以來，中國對該病進行了大量病原學和流行病學研究，為了與甲型腦炎相區(qū)別，定名為流行性乙型腦炎，簡稱乙腦，是中國夏秋季流行的主要傳染病之一，除新疆、西藏、青海外，全國各地均有病例發(fā)生，年發(fā)病人數(shù)2.5萬，病死率10%，大約15%的患者留有不同程度的后遺癥。?

日本腦炎病毒（Japanese?Encephalitis?virus）屬于黃病毒科甲病毒屬。該病毒呈球形，直徑約40nm，二十面體立體對稱的核衣殼，內(nèi)有衣殼蛋白（C）與核酸構(gòu)成的核心，外披以含脂質(zhì)的囊膜，表面有囊膜糖蛋白（E）刺突，即病毒血凝素，囊膜內(nèi)尚有內(nèi)膜蛋白（M），參與病毒的裝配。病毒基因組為單股正鏈RNA，全長11kb，自5′至3′端依次編碼結(jié)構(gòu)蛋白C、M、E以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS1—NS5，病毒RNA在細胞漿內(nèi)直接起mRNA作用，翻譯出結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，在胞漿粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)裝配成熟，出芽釋放。?

目前，有許多技術(shù)可用于JEV的檢測，如免疫熒光法、免疫組織化學技術(shù)、直接電鏡、免疫電鏡、酶聯(lián)免疫吸附試驗、阻斷ELISA、鏈霉親和素-生物素技術(shù)、原位雜交法、競爭阻斷ELISA。然而這些檢測方法不但需要昂貴的設(shè)備儀器花費較長的時間，而且特異性和敏感性較低。因此，在實驗室建立一種快速，?敏感，特異的檢測JEV的診斷方法是十分必要的。?

環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)（LAMP）：LAMP是由日本的Notomi（Notomi?et?al，2000）在2000年發(fā)明的一種全新的核酸擴增方法。該技術(shù)依賴于能夠識別靶序列上6個特異區(qū)域的4條引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下（60℃-65℃）可高效、快速、特異的擴增靶序列。LAMP法不僅能擴增DNA，也能擴增RNA，只需在反應(yīng)體系中加入一定量的反轉(zhuǎn)錄酶就能實現(xiàn)擴增，整個反應(yīng)時間非常短，此技術(shù)設(shè)備要求低，一個恒溫箱或水浴鍋就能完全反應(yīng)。近年來，國內(nèi)外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測。Hong?TC等人（Development?and?evaluation?of?a?novel?loop-mediated?isothermal?amplification?method?for?rapid?detection?of?severe?acute?respiratory?syndrome?coronavirus.ClinMicrobiol,2004May；42(5):1956-61）于2004年根據(jù)LAMP原理設(shè)計了實時定量RT-LAMP方法，以快速檢測SARS-Cov，結(jié)果RT-LAMP的靈敏度是RT-PCR的100倍；Masaki?Imai等人（Rapid?diagnosis?of?H5N1?avian?influenza?virus?infection?by?newly?developed?influenza?H5?hemagglutinin?gene-specific?loop-mediated?isothermal?amplification?method.Virol?Methods.2007May，141(2):173-80.）于2007年建立了快速診斷H5N1禽流感病毒的RT-LAMP檢測體系。由于LAMP的擴增產(chǎn)物是白色焦磷酸鎂沉淀，用肉眼難以觀察，日本已研制出專門對LAMP產(chǎn)物進行實時監(jiān)控的濁度儀。但是濁度儀的使用不但增加了費用，而且不方便攜帶；有學者利用往反應(yīng)后的體系中加入SYBR?Green?I染料的方法來檢測擴增產(chǎn)物，但是這樣觀察又必需開蓋處理，LAMP擴增的高效性及高敏感性使得產(chǎn)物中含有大量目的片段，開蓋添加染料極其容易污染環(huán)境。后來，有研究對LAMP方法作進一步改進，在原有LAMP反應(yīng)試劑的基礎(chǔ)上添加鈣黃綠素和氯化錳后，可以衍生出另外一種更為簡便的可視化LAMP，一步即可完成LAMP擴增及結(jié)果判定，LAMP產(chǎn)物無需開蓋分析即可用肉眼觀察結(jié)果。但這種方法因存在假陽性率過高、弱陽性結(jié)果的判別不夠準確、且鈣黃綠素與錳離子的濃度配比體系不穩(wěn)定等缺點而使該方法的應(yīng)用推廣受到限制。?